前列腺癌相關(guān)基因PC-1功能研究及其調(diào)控通路初探.pdf

1、PC-1基因是周建光研究員發(fā)現(xiàn)并克隆的新基因，該基因在雄激素非依賴、可轉(zhuǎn)移的前列腺癌晚期細(xì)胞系C4-2中高表達(dá)，而在雄激素依賴、不轉(zhuǎn)移的前列腺癌早期細(xì)胞系LNCaP中低表達(dá)。PC-1屬于癌蛋白TPD52家族，編碼一個(gè)包含224個(gè)氨基酸的蛋白分子，C端180個(gè)氨基酸與D52家族蛋白序列高度同源的，N端46個(gè)氨基酸是其特異的區(qū)域。TPD52家族成員在多種類型腫瘤中高表達(dá)，基因表達(dá)與細(xì)胞的增殖和惡變相關(guān)。不同于TPD52家族成員，PC-1基因

2、表達(dá)受雄激素正調(diào)控，主要在前列腺組織中表達(dá)。前期的研究發(fā)現(xiàn)PC-1基因定位于染色體8q21.1區(qū)域，該區(qū)域在前列腺癌組織標(biāo)本中普遍擴(kuò)增。利用前列腺癌的臨床組織樣本做免疫組化試驗(yàn)表明PC-1基因在前列腺癌和前列腺內(nèi)皮增生(PIN)的樣本中的表達(dá)普遍較正常前列腺樣本中低。將PC-1基因在小鼠成纖維NIH3T3細(xì)胞中穩(wěn)定性高表達(dá)的結(jié)果顯示，該基因可使永生化的NIH3T3細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。前期的研究提示PC-1基因可能作為癌基因特異性的在

3、前列腺癌中起作用。 本研究首先建立穩(wěn)定高表達(dá)PC-1基因的細(xì)胞株C4-2B-PC-1及其對(duì)照細(xì)胞株C4-2B-neo。以這兩個(gè)細(xì)胞株為基礎(chǔ)，利用MTT實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，同時(shí)用RT-PCR和Real time PCR檢測(cè)了基因表達(dá)譜的變化，探討PC-1基因在C4-2B細(xì)胞中的功能。我們發(fā)現(xiàn)PC-1基因高表達(dá)之后引起了C4-2B細(xì)胞的增殖和惡性程度的提高，在撤除雄激素的條件下促進(jìn)C4-2B細(xì)胞生長，并能導(dǎo)致一系列生長分化基因

4、表達(dá)的改變。為了研究PC-1基因發(fā)揮功能的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步研究了LNCaP-PC-1和對(duì)照細(xì)胞中受PC-1基因表達(dá)所調(diào)控的基因，重點(diǎn)研究了受體酪氨酸蛋白激酶(RTK)信號(hào)通路成員EphA3和SGEF/CSGEF。通過一系列實(shí)驗(yàn)探討了這兩個(gè)分子的功能，嘗試著去解釋PC-1基因發(fā)揮功能的方式，其參與的信號(hào)的通路，或者受其調(diào)控的通路。我們的結(jié)果證明EphA3和SGEF/CSGEF能夠發(fā)生相互作用，而EphA3和SGEF/CSGEF是PC-

5、1基因的應(yīng)答分子，提示PC-1基因可能通過調(diào)控RTK信號(hào)通路來影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。利用GST pull down實(shí)驗(yàn)，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SGEF與雄激素受體AR能夠在體內(nèi)體外相互作用。進(jìn)一步利用GST pull down實(shí)驗(yàn)和哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)確定與AR發(fā)生相互作用的區(qū)域是SGEF的PH domain，而與SGEF發(fā)生相互作用的是AR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域LBD。另外獨(dú)立的研究證明PC-1能夠與AR發(fā)生相互作用，由雄激素激活

6、的雄激素受體信號(hào)通路在前列腺的分化、維持和前列腺癌的發(fā)展中起到重要的作用，而我們的研究提示PC-1基因參與的RTK信號(hào)通路與雄激素受體信號(hào)通路之間存在著某種聯(lián)系，同時(shí)也說明PC-1基因參與的調(diào)控體系是一個(gè)復(fù)雜的的網(wǎng)絡(luò)。為研究SGEF/CSGEF在前列腺癌中的功能，我們制備了其兔多克隆抗體。得到了特異性較好，效價(jià)較高的兔抗血清。為了研究與AR相互作用的SGEF對(duì)雄激素受體的轉(zhuǎn)錄激活活性的影響。我們進(jìn)一步在LNCaP細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系中利用