Fox01對(duì)糖尿病大鼠足細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)微血管并發(fā)癥之一，常導(dǎo)致終末期腎病。DN足細(xì)胞損傷常表現(xiàn)為足突融合消失、細(xì)胞體積逐漸變小、陰離子電荷減少，最終足細(xì)胞可從腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)上脫落到腎小囊里并從尿液中排出[1]。目前，隨著足細(xì)胞系的建立，足細(xì)胞損傷在DN發(fā)病中被認(rèn)為是引起DN蛋白尿和腎小球硬化的關(guān)鍵[2]。
　　叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（Forkhead

2、 transcription factor O1，F(xiàn)oxO1）是FoxO家族中的一員，當(dāng)被磷酸化后可導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性降低，引起FoxO1靶基因的表達(dá)下降[3]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)[4]發(fā)現(xiàn)DN大鼠腎皮質(zhì)FoxO1表達(dá)及活性下降，隨后[5]又發(fā)現(xiàn)DN治療組大鼠腎臟的FoxO1較未治療組磷酸化水平顯著降低，活性顯著增強(qiáng)，電鏡下足突融合減輕，提示FoxO1的活性變化可能和DN中足細(xì)胞損傷情況有關(guān)，但并沒有驗(yàn)證兩者的直接關(guān)系，目前國內(nèi)外也沒有相關(guān)報(bào)

3、道。另有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與了DN足細(xì)胞損傷的發(fā)生與發(fā)展。Foxo1作為PI3K/Akt信號(hào)通路的下游因子，我們認(rèn)為其活性的改變很可能也參與了DN足細(xì)胞的損傷過程。
　　本研究旨在通過上調(diào)FoxO1的表達(dá)，觀察FoxO1對(duì)糖尿病大鼠足細(xì)胞的影響。
　　材料與方法：
　　健康、雄性清潔級(jí)SD大鼠120只，體重(100±20)g，IVC系統(tǒng)中喂養(yǎng)。待大鼠達(dá)到8周齡，體重(220±20)g，隨機(jī)選

4、取90只建立DM大鼠模型，并隨機(jī)分為DM+空慢病毒(LV-pSC-GFP)感染組（a組，n=30），DM+大鼠結(jié)構(gòu)性活性FoxO1慢病毒(LV-CA-FoxO1)感染組（b組，n=30），DM組（d組，n=30）。剩余大鼠注射相等體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液作為正常對(duì)照組(c組，n=30)。DM大鼠造模方法如下:將其禁食12h后，按60mg/kg一次性腹腔注射1％STZ溶液，72h后連續(xù)三次測(cè)定血糖(BG)≥16.7mmol/L，為DM

5、成模標(biāo)準(zhǔn)。各組大鼠自由進(jìn)食飲水，不給予任何降糖藥物治療。待DM大鼠造模成功、血糖穩(wěn)定5天后，采用腎臟多部位靶向注射重組慢病毒的方法[7]分別將100ulLV-pSC-GFP、LV-CA-FoxO1（慢病毒滴度檢測(cè)為7×108TU/ml，綜合考慮慢病毒感染效率及細(xì)胞毒性后明確感染大鼠的最佳感染量為100ul）注射到a、b組大鼠的右腎皮質(zhì)多個(gè)部位。c組和d組注射等量的生理鹽水。于感染后的2、4、8w末，將各組大鼠置于代謝籠收集24小時(shí)尿，離

6、心后保存于4℃冰箱，用來測(cè)定24小時(shí)尿蛋白(UPro/24h)、尿白蛋白定量(UAlb)以及尿沉渣中足盂蛋白(podocalyxin，PCX)的含量。麻醉后內(nèi)眥靜脈取血，分離血清檢測(cè)血肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）。處死大鼠取出右腎去包膜測(cè)腎重并進(jìn)行以下取材。a、b兩組大鼠取右腎背側(cè)下1/2做冰凍切片以及光鏡切片，觀察慢病毒感染情況，c、d組直接將切下的背側(cè)下1/2組織置于4％多聚甲醛中固定用于制作光鏡切片觀察腎小球病理學(xué)變化。a、b

7、、e、d四組取米粒(約1mm3)大小腎組織（包括注射點(diǎn)在內(nèi)）迅速放入冷戊二醛固定液中用于電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)變化，剩余腎組織迅速置于-80℃冰箱里，用于Real-timePCR和Western blotting檢測(cè)FoxO1、足盂蛋白(podocalyxin，PCX)、nephrin、Ⅳ型膠原α3鏈(COL4A3)、Ⅳ型膠原α5鏈(COL4A5)、結(jié)蛋白(desmin)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.熒光顯微鏡下，可觀察到a組

8、和b組大鼠腎臟冰凍切片中都有綠色熒光蛋白(GFP)的有效表達(dá)，提示慢病毒感染成功。
　　2.2周末，四組大鼠的UPro/24h、UAlb、Scr、BUN差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與c組比較，a、d組BG升高，KI升高（均P＜0.05），BW降低(P＜0.05)，b組與a、d組比，BG、BW無明顯差別(P＞0.05)，KI降低(P＜0.05)，但仍高于c組(P＜0.05)。在4、8周末，與c組相比，a、d組BG、KI、UPr

9、o/24h、UAlb、Scr、BUN水平顯著升高，BW水平明顯降低（均P＜0.05）;與a、d組比較，b組KI、UPro/24h、UAlb、Scr和BUN水平明顯降低（均P＜0.05），但仍高于c組(P＜0.05)，b組BG水平較a、d組略有下降、BW水平略有上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。a組和d組各觀察點(diǎn)各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.ELISA結(jié)果:2、4、8周末，與c組相比，a組和d組大鼠尿沉渣中

10、PCX含量顯著增高(P＜0.05);與a、d組比較，b組尿沉渣PCX含量明顯下降(P＜0.05)，但仍高于c組(P＜0.05);a與d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。除c組外，各組該指標(biāo)呈時(shí)間依賴性變化。
　　4.在2、4、8周末各個(gè)觀察點(diǎn)上，a和d組大鼠腎皮質(zhì)中的FoxO1、nephrin、PCXmRNA表達(dá)水平顯著低于c組(P＜0.05);b組大鼠三者mRNA表達(dá)水平顯著高于a、d組(P＜0.05)，但nephrin、PC

11、X的mRNA水平仍低于c組(P＜0.05)，同時(shí)FoxO1顯著高于c組(P＜0.05)。a組和d組腎皮質(zhì)中COL4A3、COL4A5以及desminmRNA表達(dá)水平顯著高于c組(P＜0.05);b組這三項(xiàng)指標(biāo)較a和d組顯著下降(P＜0.05)，但仍高于c組(P＜0.05)。a組和d組各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.Westernblot結(jié)果顯示，在第2、4、8周末各個(gè)觀察點(diǎn)上，a組和d組較c組大鼠腎皮質(zhì)中的Fo

12、xO1蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P＞0.05)，但FoxO1/p-FoxO1、nephrin、PCX蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，b組大鼠腎臟FoxO1、nephrin、PCX蛋白表達(dá)水平顯著高于a、d兩組(P＜0.05)，但nephrin、PCX仍低于c組(P＜0.05)，同時(shí)b組的FoxO1蛋白表達(dá)水平與FoxO1/p-FoxO1顯著高于c組(P＜0.05)。a、d兩組的COL4A3、COL4A5以及desmin的蛋白表達(dá)水平

13、顯著高于c組(P＜0.05);b組的COL4A3、COL4A5以及desmin蛋白這三項(xiàng)指標(biāo)較a和d組顯著下降(P＜0.05)，但仍高于c組(P＜0.05)。a組和d組各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6.腎臟病理變化:光鏡下c組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)未見明顯異常，a、d組差異不大，可見腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)增多，基底膜增厚，以8周末變化最明顯;電鏡下c組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)未見明顯異常，未見基底膜及內(nèi)皮細(xì)胞增厚