sPLA2-IIA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮功能影響的研究.pdf

1、研究背景
　　 動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）疾病是當(dāng)今國內(nèi)外發(fā)病率和病死率都較高的疾病之一。作為一種全身彌漫性的病理狀態(tài)，AS是大多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ)。炎性反應(yīng)細(xì)胞及其釋放的產(chǎn)物已被認(rèn)為是最主要的促動(dòng)脈粥樣硬化因素。ⅡA類分泌型磷脂酶A2（secretory phospholipase A2 groupⅡA，sPLA2-ⅡA）作為一個(gè)新近研究的重要的炎性反應(yīng)介質(zhì)，近年來越來越多的證據(jù)表明其在AS的發(fā)生

2、和發(fā)展中也有重要作用。目前關(guān)于sPLA2-ⅡA的研究多集中在對(duì)巨噬細(xì)胞的影響以及與脂代謝的關(guān)系上，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的研究較少，還沒有研究說明sPLA2-ⅡA對(duì)內(nèi)皮功能的影響。內(nèi)皮功能紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)，明確sPLA2-ⅡA的致炎效應(yīng)是否會(huì)影響血管內(nèi)皮功能，有助于理解sPLA2-ⅡA致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制，并有助于采取針對(duì)性的措施預(yù)防AS的發(fā)生。
　　 研究目的
　　 1.通過測(cè)定與分析多種內(nèi)皮細(xì)胞分泌因子的表達(dá)

3、水平，包括一氧化氮（nitricoxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin，ET-1）、一氧化氮合酶（nitric oxidesynthase，eNOS），細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞粘附分子-1（vascular cell adhesionmolecule-1，VCAM-1），探索不同濃度的sPLA2-ⅡA刺激對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響。
　

4、　 2.通過觀察4-BPB（4-bromophennacyl bromide，sPLA2-ⅡA水解作用的抑制劑）對(duì)sPLA2-ⅡA誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能影響的變化，初步探討sPLA2-ⅡA的作用機(jī)制，以了解sPLA2-ⅡA的水解作用是否參與了對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。
　　 研究方法：
　　 1.體外分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）。
　　

5、 2.不同濃度的sPLA2-ⅡA體外刺激HUVEC細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)濃度（0.01、0.1、1ug/ml），以未加任何藥物刺激培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對(duì)照，以10ng/ml TNF-α刺激培養(yǎng)的細(xì)胞作為陽性對(duì)照，利用試劑盒檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞上清的一氧化氮濃度，并利用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（Real-Time PCR）方法分析一氧化氮合酶（eNOS）、內(nèi)皮素-1（endothelin，ET-1）、細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）和血管粘附分子-1（

6、VCAM-1）的mRNA表達(dá)水平的變化，還利用Western Blot法分析ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表達(dá)水平變化。
　　 3.采用體外分離培養(yǎng)HUVEC的方法，以1 ug/ml sPLA2-ⅡA、10nmol/L4-BPB單獨(dú)或聯(lián)合刺激內(nèi)皮細(xì)胞，利用試劑盒檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞上清的一氧化氮濃度，并通過Real-Time PCR檢測(cè)分析eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1轉(zhuǎn)錄水平的變化，用Western Blot法

7、分析ICAM-1、VCAM-1在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　 4.用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用單因素方差分析（one-wayANOVA），多重比較采用LSD和SNK法。p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.0.1 ug/ml和1 ug/ml的sPLA2-ⅡA均能誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1mRNA的表達(dá)（p<0.01），且誘導(dǎo)作用呈濃度依賴性（p<0.05）

8、：并且sPLA2-ⅡA可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)水平，呈濃度依賴性。
　　 2.4-BPB干預(yù)組細(xì)胞的ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表達(dá)較1 ug/ml sPLA2-ⅡA單獨(dú)刺激組顯著降低（ICAM-1:0.65±0.12 VS0.35±0.08，p<0.01；VCAM-1:0.85±0.14 VS0.60+0.21，p<0.05），4-BPB處理也明顯降低10ng/ml TNF-a誘導(dǎo)的ICAM-

9、1、VCAM-1 mRNA的表達(dá)（ICAM-1:0.72±0.03 VS0.47±0.03，p<0.05；VCAM-1:1.24±0.04 vs0.82±0.09，p<0.05）；4-BPB處理降低sPLA2-ⅡA或TNF-a誘導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達(dá)。
　　 3.0.01ug/ml、0.1ug/ml、1 ug/ml的sPLA2-ⅡA均能誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ET-1mRNA的表達(dá)（p<0.01），并且誘導(dǎo)作用呈濃度

10、依賴性（p<0.05）；1 ug/ml sPLA2-ⅡA能明顯抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA的表達(dá)（p<0.01），但濃度低于1 ug/ml的sPLA2-ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA的表達(dá)影響不明顯（p>0.05）；0.1ug/ml和1 ug/ml的sPLA2-ⅡA均能明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成（P<0.05，p<0.01）。
　　 4.4-BPB處理明顯減弱1 ug/ml sPLA2-ⅡA調(diào)節(jié)的ET-1、eNOS m

11、RNA的表達(dá)（ET-1：1.52±0.06 VS1.13±0.06，p<0.01：eNOS：-0.38±0.01 VS-0.15±0.02，p<0.05）；4-BPB處理也明顯減弱10ng/ml TNF-a調(diào)節(jié)的ET-1、eNOS mRNA的表達(dá)（ET-1:1.89±0.00 VS1.38±0.05，p<0.01；eNOS：-1.52±0.12 VS-0.96±0.04，p<0.01），但是4-BPB處理對(duì)sPLA2-ⅡA及TNF-α抑

12、制內(nèi)皮細(xì)胞NO生成的作用不明顯（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.sPLA2-ⅡA能劑量依賴性地誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、ET-1的表達(dá)，抑制eNOS的表達(dá)，減少NO的生成。
　　 2.sPLA2-ⅡA的水解作用是其影響內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、ET-1和eNOS表達(dá)的機(jī)制之一。
　　 3.TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、VCAM-1、ET-1、eNOS的過程中可能