體外合成GPC3和GPC3-SiRNA真核質(zhì)粒載體及轉(zhuǎn)染Huh-7細胞的研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩69頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、[目的]
   通過體外構(gòu)建真核表達質(zhì)粒載體pcDNA3.1+GPC3和GPC3-siRNA-1633,應(yīng)用酶切測序法進行鑒定;通過脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染入Huh-7細胞中,運用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的活性,熒光定量PCR和Western Blot分別檢測Huh-7細胞GPC3mRNA和蛋白的表達;旨在探討體外合成GPC3和GPC3-siRNA真核質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染Huh-7細胞的可行性。
   [方法]
   1、應(yīng)用s

2、iRNA設(shè)計軟件篩選能與GPC3mRNA配對的siRNA,并選擇對GPC3mRNA抑制率最高的siRNA;
   2、在Gene Bank中查找GPC3的基因序列,運用Trizol法提取腎組織總RNA,并進行逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴增GPC3基因編碼區(qū);
   3、利用限制性內(nèi)切酶BamH1和Bbs1將GPC3基因編碼區(qū)插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1+中;
   4、運用Blast和NCBI/BLAST/Formatti

3、ng Results-JU73V5UH01N比對插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中的GPC3序列。
   5、采用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核質(zhì)粒載體pcDNA3.1+GPC3和GPC3-siRNA-1633分別轉(zhuǎn)染至Huh-7細胞。
   6、運用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后Huh-7細胞的細胞活性。
   7、通過熒光定量PCR和Western Blot檢測GPC3mRNA和蛋白的表達變化。
   [結(jié)果]

4、   1、可篩選出符合配對的siRNA為GPC3-siRNA-1564、GPC3-siRNA-1718、GPC3-siRNA-2134、GPC3-siRNA-1633、GPC3-siRNA-647、GPC3-siRNA-714,共6對;其中GPC3-siRNA-1633的抑制率最高。
   2、在Gene Bank中查找GPC3的基因序列,經(jīng)提取腎組織RNA,并進行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增GPC3基因編碼區(qū)的序列F為5'GATTCAG

5、CCTTGGACATCAATG3',與原始序列完全一致。
   3、Blast和NCBI/BLAST/Formatting Results-JU73V5UH01N比對插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中GPC3序列未出現(xiàn)變異。
   4、GPC3-siRNA-1633和GPC3真核表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Huh-7細胞后細胞活性沒有改變,存活率高。
   5、GPC3-siRNA-1633真核質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)染Huh-7細胞后

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論