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文檔簡介
1、[目的]
通過體外構(gòu)建真核表達質(zhì)粒載體pcDNA3.1+GPC3和GPC3-siRNA-1633,應(yīng)用酶切測序法進行鑒定;通過脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染入Huh-7細胞中,運用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的活性,熒光定量PCR和Western Blot分別檢測Huh-7細胞GPC3mRNA和蛋白的表達;旨在探討體外合成GPC3和GPC3-siRNA真核質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染Huh-7細胞的可行性。
[方法]
1、應(yīng)用s
2、iRNA設(shè)計軟件篩選能與GPC3mRNA配對的siRNA,并選擇對GPC3mRNA抑制率最高的siRNA;
2、在Gene Bank中查找GPC3的基因序列,運用Trizol法提取腎組織總RNA,并進行逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴增GPC3基因編碼區(qū);
3、利用限制性內(nèi)切酶BamH1和Bbs1將GPC3基因編碼區(qū)插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1+中;
4、運用Blast和NCBI/BLAST/Formatti
3、ng Results-JU73V5UH01N比對插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中的GPC3序列。
5、采用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核質(zhì)粒載體pcDNA3.1+GPC3和GPC3-siRNA-1633分別轉(zhuǎn)染至Huh-7細胞。
6、運用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后Huh-7細胞的細胞活性。
7、通過熒光定量PCR和Western Blot檢測GPC3mRNA和蛋白的表達變化。
[結(jié)果]
4、 1、可篩選出符合配對的siRNA為GPC3-siRNA-1564、GPC3-siRNA-1718、GPC3-siRNA-2134、GPC3-siRNA-1633、GPC3-siRNA-647、GPC3-siRNA-714,共6對;其中GPC3-siRNA-1633的抑制率最高。
2、在Gene Bank中查找GPC3的基因序列,經(jīng)提取腎組織RNA,并進行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增GPC3基因編碼區(qū)的序列F為5'GATTCAG
5、CCTTGGACATCAATG3',與原始序列完全一致。
3、Blast和NCBI/BLAST/Formatting Results-JU73V5UH01N比對插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中GPC3序列未出現(xiàn)變異。
4、GPC3-siRNA-1633和GPC3真核表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Huh-7細胞后細胞活性沒有改變,存活率高。
5、GPC3-siRNA-1633真核質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)染Huh-7細胞后
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