大黃酚對β-淀粉樣肽（25-35）致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用.pdf

1、目的：大黃酚(Chrysophanol,Chry)化學(xué)名為1，8-二羥基-3甲基葸醌(1，8-dihydroxy-3methyl anthraquinone)，屬于羥基蒽醌類，分子量為254．23，是大黃(rhubarb)的有效成分之一。國內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)大黃的報道很多，其作用極其廣泛。早期藥理研究表明，大黃有抗菌、瀉下、抗高脂血癥、降低血壓、抗腫瘤等作用，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)大黃還具有改善肝腎功能、消炎利膽、保護(hù)胃腸粘膜及肺功能、抑制血栓

2、形成、防止冠心病發(fā)生等作用。特別是近年來實(shí)驗(yàn)研究表明，大黃具有抗衰老作用，能清除氧自由基、抑制膽堿酯酶、增強(qiáng)血及腦組織中超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneoeroxidase,GSH-px)活性，改善學(xué)習(xí)記憶障礙，所以大黃是一種極具開發(fā)價值的藥用植物。而作為大黃有效成分之一的大黃酚，也有多方面的作用，已有報道其可抑制脂質(zhì)過氧化，減少氧自由基生成、抗炎等，而上述作用

3、均對學(xué)習(xí)記憶減退有改善作用。但其對Aβ造成小鼠衰老模型的學(xué)習(xí)記憶改善作用尚未報道。 癡呆(dementia)是一組臨床癥狀，是在無意識障礙時的記憶障礙和認(rèn)知功能缺損。與年齡增長伴行的認(rèn)知功能障礙即老年性癡呆(senile dementia,SD)是多種原因引起的老年性神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變。阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年性癡呆的一種，亦即老年性癡呆阿爾茨海默型(seniledementia of

4、Alzheimer type,SDAT)。AD主要臨床表現(xiàn)為患者智力、記憶力及認(rèn)知功能進(jìn)行性下降。其主要神經(jīng)病理特征是大腦皮質(zhì)的萎縮、細(xì)胞外存在的大量老年斑(senileplaques,SP)和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)(nuerofibrillarytangles,NFT)以及皮質(zhì)動脈和小動脈的血管淀粉樣變性。SP又稱為軸索斑，其核心是β淀粉樣肽(β-amyloid peptide,Aβ)。Aβ可引起神經(jīng)細(xì)胞損傷、死亡，造成實(shí)驗(yàn)動物記憶

5、障礙，因此阻斷或延遲Aβ的早期積聚成為治療AD的切入點(diǎn)。本課題擬采用Ap25.35側(cè)腦室注射造成AD動物模型，同時采用避暗法和Morris水迷宮法觀察大黃酚對Aβ所致AD動物學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用，以及測定動物腦組織一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthese,NOS)含量，并通過光鏡、電鏡實(shí)驗(yàn)觀察Aβ、大黃酚對動物海馬結(jié)構(gòu)的影響，探討大黃酚改善學(xué)習(xí)記憶的可能機(jī)制，為AD的有效治療

6、提供新的藥物。 方法：♂昆明種小鼠1 00只，隨機(jī)分成5組：生理鹽水(NS)對照組，Aβ<,25-35>模型組，大黃酚(10.0，1.0,0.1 mg·kg<'-1>)組。d l，生理鹽水對照組icv NS 3μL，其它各組icv Aβ<,25-35> 3μL(1 mmol·L<'-1>)。icv后立即ip：生理鹽水對照組和Aβ<,25-35>模型組分別ip溶劑O.1 mL·10g～；大黃酚(10.O，1.O，O.1 mg·

7、kg<'-1>)組ip大黃酚(1.00,0.10,0.01.g L<'-1>)O.1 mL·10g<'-1>。d 2-d 17，各小鼠每天ip一次；d 8-d 17，每天ip后60 min進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 d8-d16進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察大黃酚(10.0，1.0,0.1 mg·kg<'-1>)對Aβ<,25-35>造成記憶障礙的改善作用。d8，避暗實(shí)驗(yàn)(step through test)，電腦自動記錄180 s內(nèi)小鼠進(jìn)

8、入暗室的潛伏期和錯誤次數(shù)。24 h后以同樣方法記錄小鼠錯誤次數(shù)和潛伏期，測驗(yàn)小鼠記憶成績。d 11-d 15，Morris水迷宮隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)(The test of gaining concealedplatform)，每只小鼠每天訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練120 s，連續(xù)5天。記錄小鼠尋找站臺的潛伏期、游泳路徑長度及所采取的搜索策略。d 16，Morris水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)(spatial probetest)，將可移動位置的圓柱形透明有

9、機(jī)玻璃站臺從水池中取出，水深不變。每只小鼠訓(xùn)練4次，每次采用不同的入水點(diǎn)，記錄小鼠120 S穿越站臺所處位置的次數(shù)。d17，測定小鼠腦組織NO，NOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合N(inducible nitric oxide synthase，iNOS)含量。將小鼠快速斷頭取腦，制成10％腦勻漿。取適量上清液按試劑盒說明進(jìn)行NO、NOS、iNOS活性測定。 另取♂昆明種小鼠50只，隨機(jī)分成5組，分組、給藥同上。d 16，小鼠斷頭取腦，

10、采用常規(guī)HE染色及鈾一鉛染色并制備切片，分別在光鏡和電鏡下觀察小鼠海馬區(qū)的病理改變。 結(jié)果： 1 Aβ<,25-35>對小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響及大黃酚的保護(hù)作用結(jié)果表明：Aβ<,25-35>可造成記憶障礙，模型組與NS組相比小鼠進(jìn)入暗室潛伏期縮短、錯誤次數(shù)增加、錯誤百分率增加；而大黃酚(10.0，1.0，0.1 mg·kg<'-1>)均可不同程度地改善Aβ<,25-35>所致學(xué)習(xí)記憶障礙。 2 Aβ<,25-35

11、>對小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響及大黃酚的保護(hù)作用 2.1 隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Aβ<,25-35>造成了小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的障礙，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各實(shí)驗(yàn)組潛伏期、游泳路徑長度均不斷縮短。模型組與NS組相比潛伏期、游泳路徑顯著延長；而大黃酚(10.0，1.0，0.1 mg.kg<'-1>)均可不同程度地改善Aβ<,25-35>所致空間學(xué)習(xí)記憶障礙。在訓(xùn)練開始時，各組小鼠主要以邊緣式和隨機(jī)式策略尋找站臺；隨著訓(xùn)練次

12、數(shù)逐漸增加，這兩種搜索策略的出現(xiàn)率逐漸下降，而NS組和各劑量大黃酚組的下降速度和程度較模型組快；相反，趨向式和直線式搜索策略增加，NS組和各劑量大黃酚組的上升速度和程度較模型組快。 2.2 空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Aβ<,25-35>造成了小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的障礙，而大黃酚(10.0，1.0，0.1 mg·kg<'-1>)不同程度地改善了Aβ<,25-35>所致的空間學(xué)習(xí)記憶障礙。模型組與NS組相比穿越平臺區(qū)域次數(shù)減少，而大黃

13、酚(1 0.0，1.0,0.1mg·kg<'-1>)組與模型組相比穿越平臺區(qū)域次數(shù)增加。 3 大黃酚對小鼠腦組織NO含量，總NOS和iNOS活性的影響結(jié)果顯不：icV Aβ<,25-35> 3μL(1 mmol·L<'-1>)后17d，可引起小鼠腦組織NO含量增加和總NOS、iNOS活性升高(P<0.01)；而連續(xù)給予大黃酚(10.0，1.0,0.1 mg.kg<'-1>)17d，均可降低小鼠腦組織中NO含量及總NOS、iNO

14、S活性(P<0.01)。 4 Aβ<,25-35>腦內(nèi)定位注射引起的腦內(nèi)神經(jīng)形態(tài)病理學(xué)變化及大黃酚的改善作用 4.1 光鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：NS組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常；模型組海馬區(qū)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)不清、外形不規(guī)則的神經(jīng)元，神經(jīng)元間有寬窄不等的間隙；大黃酚(10.0，1.0，0.1 mg·kg<'-1>)組上述病理學(xué)改變不同程度減輕。 4.2 電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：NS組神經(jīng)元、神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)正常。模型組神經(jīng)元細(xì)胞器減少，并

15、見脂褐素樣小體，有些神經(jīng)元呈現(xiàn)凋亡早期改變，另外可見神經(jīng)纖維腫脹；大黃酚(10.0，1.0，0.1 mg·kg<'-1>)組上述病理學(xué)改變不同程度減輕。 結(jié)論： 1 一次性icv聚集態(tài)Aβ<,25-35> 3 μL可造成動物學(xué)習(xí)記憶障礙，而大黃酚(1 O.0，1.0，0.1 mg·kg<'-1>)可不同程度地改善hi325.35造成的學(xué)習(xí)記憶障礙。 2 一次性icv聚集態(tài)Aβ<,25-35> 3 μL可引起腦

16、組織神經(jīng)病理改變，而大黃酚(1 O.0，1.0，0.1 mg·kg<'-1>)對Aβ<,25-35>所致的腦組織神經(jīng)病理形態(tài)異常改變有不同程度的對抗作用。 3 一次性icv聚集態(tài)Aβ<,25-35> 3 μL后17天能引起小鼠腦組織NO含量增加和總NOS、iNOS活性升高(P<0.01)，大黃酚(10.0，1.0，0.1 mg·kg<'-1>)均可降低小鼠腦組織中NO含量及總NOS、iNOS活性(P<0.01)，可見大黃酚能改