1,25-二羥維生素D3通過VDR-PPARγ通路促使高糖誘導的M1型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)換.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病(DN)的發(fā)生發(fā)展不僅與腎組織浸潤的巨噬細胞數(shù)量有關，更與其所呈現(xiàn)的活化狀態(tài)密切相關。目前認為，經(jīng)典活化巨噬細胞(M1)具有促炎促纖維化作用，而替代活化巨噬細胞(M2)則發(fā)揮抗炎活性。近期研究發(fā)現(xiàn)，核受體PPARγ參與巨噬細胞表型活化過程，而活性維生素D(1，25(OH)2D3)具有鈣磷代謝調(diào)節(jié)以外的腎保護作用，但其具體作用機制目前尚未完全闡明。本研究擬通過細胞培養(yǎng)技術探討1,25(OH)2D3對高糖環(huán)境下巨

2、噬細胞活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用及其信號轉(zhuǎn)導機制。
　　方法:
　　采用葡萄糖濃度(11.1mM，20mM，25mM，30mM)和時間(0h，6h，12h，24h，36h，48h)依賴性刺激小鼠巨噬細胞系(RAW264.7)，酶活性法檢測細胞內(nèi)iNOS活力。10-8mol/L1，25(OH)2D3刺激高糖預孵育的RAW264.7細胞，RT-PCR和Western blot分別檢測M1標志物iNOS以及M2型細胞標志物MR和Arg-1

3、的表達;ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-12和IL-10的水平。然后用VDR siRNA和PPARγ拮抗劑分別沉默和阻斷相應受體后，再次用上述方法檢測M1和M2各標志物的水平，并進一步用免疫熒光觀察他們的表達。
　　結果:
　　(1)細胞內(nèi)iNOS活力呈葡萄糖濃度和時間依賴性表達增加，并且在25mmol/L葡萄糖刺激細胞24h后iNOS活力達到最大。與對照組相比，25mmol/L葡萄糖干預RAW264.7細胞

4、24h后，不僅上清液中炎性細胞因子TNF-α、IL-12表達增多，RT-PCR和Western blot結果顯示M1標志物iNOS也表達上調(diào)(P＜0.05)，而M2標志物MR和Arg-1的表達則顯著下降(P＜0.05)。(2)1，25(OH)2D3干預后，上述趨勢被逆轉(zhuǎn):M1標志物包括TNF-α、IL-12和iNOS的表達明顯減少，而M2標志物IL-10、Arg-1和MR則表達增加，并且核受體VDR和PPARγ表達也顯著增多(P＜0.0

5、5)。(3)進一步研究發(fā)現(xiàn)，VDR siRNA和PPARγ拮抗劑阻斷相應受體后，活性維生素D的上述作用均被阻斷，而沉默VDR后PPARγ表達也相應減少（與VD組比較1.16±0.08 vs0.48±0.05;P＜0.05)。同樣免疫熒光顯示與VD組相比，抑制VDR和PPARγ表達后，iNOS熒光明顯增強，MR和PPARγ熒光表達則明顯減弱。
　　結論:
　　1.高糖能誘導巨噬細胞M1型活化;
　　2.1，25-二羥維生