腫瘤相關(guān)基因t351的初步研究.pdf

1、在腫瘤免疫治療中，抗體靶向治療因其特異性強(qiáng)、靶向性高和治療過程相對較短而備受重視?？贵w靶向治療包括：抗腫瘤單克隆抗體直接體內(nèi)應(yīng)用；抗腫瘤單克隆抗體與抗腫瘤藥物、生物毒素或同位素偶聯(lián)，通過抗腫瘤單抗將效應(yīng)分子引導(dǎo)至腫瘤局部，殺傷腫瘤等。目前，在國外已有8種治療型抗體藥物被批準(zhǔn)正式進(jìn)入臨床，用于腫瘤治療。同時(shí)，將抗體偶聯(lián)上放射性核素用于腫瘤診斷也已經(jīng)在臨床得到越來越廣泛的應(yīng)用。本課題的目的即通過對腫瘤相關(guān)基因T351特異性抗體的治療腫瘤作用

2、的研究，為治療型抗體的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 在研制腫瘤治療和診斷型抗體時(shí)，有效的腫瘤抗原和相應(yīng)的高特異性抗體是兩個(gè)關(guān)鍵因素。在前期工作中利用差異顯示發(fā)現(xiàn)了一個(gè)肺癌高表達(dá)新基因t351，為了將其開發(fā)成具有腫瘤診斷或(和)腫瘤治療價(jià)值的單克隆抗體，本文做了以下研究： 一、利用生物信息學(xué)方法，對t351基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，功能和細(xì)胞定位進(jìn)行了分析和預(yù)測。分析結(jié)果表明，該基因編碼蛋白是與物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)的膜定位蛋白，具有6個(gè)跨膜區(qū)。利用R

3、T-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR方法，在mRNA水平對t351基因在多發(fā)腫瘤及瘤旁組織和多種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，該基因在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中呈廣泛高表達(dá)，其腫瘤組織中的表達(dá)水平是相應(yīng)癌旁組織的1.3～9.2倍。 二、根據(jù)對糖基化和磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果，選取了編碼胞外區(qū)的一段基因序列進(jìn)行表達(dá)。構(gòu)建了所選t351基因片段的原核表達(dá)質(zhì)粒pET25b(+)—351philic。經(jīng)過轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL—21，IPT

4、G誘導(dǎo)表達(dá)，純化等一系列工作，獲得了該基因的編碼重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE，Western等方法鑒定，得到的蛋白純度較高，可以用來作為抗原制備相應(yīng)的單克隆抗體。 三、用制備的蛋白免疫BALB/C小鼠，通過經(jīng)典雜交瘤技術(shù)，制備出了針對t351蛋白親水片斷的單克隆抗體。經(jīng)過對得到單抗的一系列鑒定，篩選出三株雜交瘤細(xì)胞，C1—1，C1—8和C6—5。這三株雜交瘤細(xì)胞抗體效價(jià)高，可結(jié)合原核表達(dá)的t351蛋白親水片段以及高表達(dá)t351基

5、因的細(xì)胞膜蛋白。將雜交瘤小鼠腹腔注射獲得腹水，經(jīng)純化得到了高純度的單克隆抗體。 四、以得到的單抗為工具，經(jīng)免疫組化，流式細(xì)胞分析，從蛋白水平分析了t351基因在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞的表達(dá)，以及其在組織和細(xì)胞中的定位情況。結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白在腫瘤組織和細(xì)胞都有較高的表達(dá)。免疫組化結(jié)果還觀察到該蛋白同時(shí)表達(dá)在胞漿和胞膜。 五、以BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞HepG2，HT29和GLC—82為靶細(xì)

6、胞，t351蛋白單抗C1—1為中介，行ADCC實(shí)驗(yàn)；研究該抗體作為治療型抗體的可行性。結(jié)果表明，C1—1介導(dǎo)了較高的殺傷效應(yīng)，可進(jìn)一步用于腫瘤免疫治療的研究。 六、用放射性核素99mTc標(biāo)記單抗C1—1，做體外結(jié)合腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和荷瘤小鼠體內(nèi)顯影。二者結(jié)果均不理想。其可能原因是標(biāo)記抗體條件不適合，使得標(biāo)記后抗體對細(xì)胞的結(jié)合下降。 綜上所述，t351基因是一個(gè)在腫瘤中廣泛表達(dá)和高表達(dá)的基因，其編碼蛋白為膜蛋白，可以做為腫瘤免