白藜蘆醇對(duì)高脂喂養(yǎng)C57BL-6J小鼠肝臟脂代謝及LXRα蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和居民生活水平的提高，我國(guó)的膳食結(jié)構(gòu)正在逐漸向西方化轉(zhuǎn)變，膳食高能量、高脂肪和體力活動(dòng)減少造成非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率快速上升。肝臟是機(jī)體脂代謝的中心器官，涉及肝臟對(duì)外源性脂質(zhì)的消化吸收，肝內(nèi)脂蛋白的代謝、膽固醇的轉(zhuǎn)化與分解等多個(gè)環(huán)節(jié)。若其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，就可能破壞脂肪酸的攝取、氧化、合成、酯化和甘油三酯及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)

2、態(tài)平衡，造成脂質(zhì)代謝紊亂。因此，預(yù)防和改善NAFLD的發(fā)生發(fā)展對(duì)促進(jìn)我國(guó)人民的健康具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 白藜蘆醇( resveratrol，RSV)是一種植物多酚類物質(zhì)，著名的“法國(guó)悖論”流行病學(xué)調(diào)查顯示RSV具有保護(hù)心血管的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RSV可以降低小鼠肝臟TG和TC水平，但其具體機(jī)制尚不明確。肝X受體α(liver X receptorα，LXRα)在肝臟廣泛表達(dá)，LXR與視黃醛衍生物受體(retinoid

3、X receptor，RXR)結(jié)合成雜聚二聚體形式才能發(fā)揮作用。膽固醇的一些代謝產(chǎn)物如羥基固醇24s，25-環(huán)氧膽固醇等是其內(nèi)源的激活配體。雜聚二聚體LXR/RXR通過(guò)直接結(jié)合在靶基因的DR4序列位點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。其中靶基因產(chǎn)物包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)移子家族(ATP-binding cassettes，ABCs)，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatoryelement binding protein，SREBP)，脂蛋

4、白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)，膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白( cholesterol ester transfer protein，CETP)，載脂蛋白E(apolipoproteinE，ApoE)等。LXRs可通過(guò)這些基因編碼相應(yīng)的蛋白來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)和膽固醇的代謝。
　　 本實(shí)驗(yàn)在對(duì)C57BL/6J小鼠喂飼高脂飼料的同時(shí)給予RSV(22.5mg/kg.bw.d)進(jìn)行灌胃干預(yù)，觀察了其對(duì)C57BL/6J小鼠肝臟脂代謝和

5、LXRα蛋白表達(dá)的影響，旨在闡明RSV對(duì)C57BL/6J小鼠肝臟脂代謝的影響及其機(jī)制。
　　 材料和方法:
　　 一、動(dòng)物的分組與喂養(yǎng)
　　 C57BL/6J小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，按體重隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、高脂組和RSV干預(yù)組，每組20只?；A(chǔ)組和高脂組在每天分別喂飼基礎(chǔ)飼料和高脂飼料的基礎(chǔ)上給予0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，白藜蘆醇干預(yù)組在喂飼高脂飼料的同時(shí)每天給予0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液溶解的濃度

6、為22.5mg/kg.bw.d的白藜蘆醇灌胃。實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠自由攝食飲水，每周稱量體重2次。
　　 二、測(cè)定指標(biāo)及方法
　　 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第8w和第16w時(shí)，每組分別取10只小鼠測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo)：
　　 1、肝臟病理學(xué)
　　 小鼠脫頸椎處死，解剖并分離肝臟。從肝右葉中部切取1.0×0.5×0.3cm大小的肝組織放入預(yù)先配置好的中性甲醛固定液中，制作成HE切片在顯微鏡下觀察肝組織病理改變。
　　

7、2、肝指數(shù)
　　 肝指數(shù)(％)=肝臟濕重(g)/體重(g)×100
　　 3、肝臟中TG、TC含量
　　 用電子天平稱取150mg～200mg肝組織，加入3倍體積的甲醇進(jìn)行勻漿，待勻漿無(wú)阻力后再加入6倍體積的氯仿，漩渦混勻器混勻制成10％的組織勻漿。室溫放置過(guò)夜，小心抽取下層有機(jī)溶劑層，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定有機(jī)溶劑層中TG、TC含量。
　　 4、肝臟游離脂肪酸(nonesterified fatty acid

8、s，NEFA)
　　 取50mg-100mg肝組織，用生理鹽水制成10％組織勻漿，3000r/min離心15min，小心吸取上清液，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定NEFA含量。
　　 5、肝臟中LXRα蛋白的表達(dá)
　　 利用RIPA蛋白裂解液提取肝組織總蛋白，紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提蛋白溶液濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，封閉，TBS-T洗膜，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBS-T洗膜，二抗孵育2h，TBS-T洗膜，ECL法顯色。利用

9、圖像分析軟件，用所測(cè)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　 三、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析
　　 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(?)±S表示，用單因素方差分析比較各組指標(biāo)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05
　　 結(jié)果:
　　 一、動(dòng)物一般狀況及體重變化
　　 實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠生長(zhǎng)發(fā)育未見(jiàn)異常情況。各組小鼠體重增量8w和16w均為高脂組最多，RSV

10、干預(yù)組最少，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 二、各組小鼠肝臟病理改變
　　 8w各組小鼠肝臟大體標(biāo)本未見(jiàn)異常，HE切片下組織細(xì)胞形態(tài)正常。16w高脂組小鼠肝臟大體標(biāo)本略呈黃褐色，有油膩感，HE切片下可見(jiàn)大量脂肪空泡形成，基礎(chǔ)組和RSV干預(yù)組肝臟大體標(biāo)本未見(jiàn)異常，HE切片下干預(yù)組與基礎(chǔ)組相似，肝細(xì)胞未見(jiàn)脂肪變性改變。
　　 三、各組小鼠肝指數(shù)
　　 8w和16w小鼠肝指數(shù)，各組間差異均無(wú)統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 四、各組小鼠肝臟TG、TC含量
　　 8w小鼠肝臟TG水平，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），16w小鼠肝臟TG水平，高脂組明顯高于基礎(chǔ)組和干預(yù)組(P＜0.05)，而干預(yù)組和基礎(chǔ)組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);8w和16w小鼠肝臟TC水平，高脂組均明顯高于基礎(chǔ)組和干預(yù)組（P＜0.05），而干預(yù)組和基礎(chǔ)組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 五、各組小鼠

12、肝臟NEFA含量
　　 8w和16w，各組小鼠肝臟NEFA含量均以高脂組最高，基礎(chǔ)組最低，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 六、各組小鼠肝臟LXRα蛋白表達(dá)
　　 8w各組小鼠肝臟LXRα蛋白相對(duì)表達(dá)量，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。16w各組小鼠肝臟LXRα蛋白相對(duì)表達(dá)量，干預(yù)組最高，高脂組最低，且兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、白藜蘆