GDNF和E2通過N-cadherin-Era-Src信號模塊協(xié)同增強激活受損DA能神經(jīng)細胞內(nèi)的PI3K-Akt信號通路.pdf

1、目的：有證據(jù)表明，膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)與17β-雌二醇(E2)能協(xié)同保護多巴胺(DA)能神經(jīng)細胞，但其具體的細胞內(nèi)分子機制不明，鑒于此兩者均可單獨激活細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路，因此我們提出GDNF和E2對DA能神經(jīng)細胞的協(xié)同保護作用是協(xié)同增強激活該細胞內(nèi)的這條信號通路而實現(xiàn)的。本研究目的主要是為證明上述假說，且進一步探討二者協(xié)同激活神經(jīng)細胞胞內(nèi)PI3-K/Akt信號通路可能機制。
　　 方法：本研究以MN

2、9D細胞（一種由胚胎小鼠中腦頂蓋DA能神經(jīng)細胞和N18TG2神經(jīng)母細胞瘤細胞融合而成的細胞系，表現(xiàn)出中腦DA能神經(jīng)細胞的明顯特征）為研究對象，6-羥基多巴胺(6-OHDA)損傷后24小時，使用GDNF、E2、雌激素α受體激動劑4,4′，4″-（4-丙基-[1H]-吡唑-1,3,5-三腈基）三苯酚(PPT)、雌激素β受體激動劑2,3-雙（4-羥苯基）-丙腈(DPN)單獨或GDNF分別與E2、PPT、DPN共同作用15min，免疫印跡檢測細

3、胞內(nèi)Akt的磷酸化水平、胞漿胞膜中雌激素受體量的改變，分別在胞漿和胞膜中應(yīng)用免疫共沉淀的方法交叉檢測GDNF的跨膜信號轉(zhuǎn)導受體Ret、NCAM、Integrinβ1、N-cadherin與胞內(nèi)信號分子雌激素受體α和β的結(jié)合量的改變，以及Src家族接頭蛋白與上述兩者的共結(jié)合。應(yīng)用Src家族蛋白抑制劑3-（4-氯苯基）-1-（1,1二甲基）1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(PP2)后免疫印跡檢測Src家族接頭蛋白對胞內(nèi)PI3-K/Ak

4、t信號通路活性的影響。
　　 結(jié)果：結(jié)果顯示，與單獨使用GDNF或E2相比，GDNF和E2的聯(lián)合應(yīng)用使受損的DA能神經(jīng)細胞內(nèi)Akt磷酸化水平顯著升高。且在GDNF和E2的同時作用下，受損的DA能神經(jīng)細胞內(nèi)的雌激素α受體(ERα)能向細胞膜內(nèi)表面聚集，并與Ret、NCAM、Integrinβ1、N-cadherin四者均有結(jié)合，尤其與含有N-cadherin胞內(nèi)段復(fù)合物的結(jié)合更加顯著，而單獨應(yīng)用GDNF或E2未見此現(xiàn)象；同時，我們

5、還觀察到Src家族的接頭蛋白也結(jié)合在同時存在有N-cadherin和ERα的復(fù)合物上，而抑制Src家族的活性后，細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路被激活的標志性現(xiàn)象Akt磷酸化水平則沒有變化。
　　 結(jié)論：上述結(jié)果表明，GDNF與E2對DA能神經(jīng)細胞的協(xié)同保護作用可能是通過增強激活PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的，其中具體的過程為通過一個同時含有N-cadherin胞內(nèi)段、ERα及Src家族接頭蛋白的信號模塊介導而協(xié)同激活PI3K/A