脫細胞半月板支架與骨髓基質(zhì)干細胞聯(lián)合培養(yǎng)的研究.pdf

1、實驗?zāi)康模喊朐掳遘浌侨睋p的治療一直是困擾醫(yī)學界的一大難題。目前的主要治療手段是行半月板切除術(shù)和部分切除術(shù)，遠期常并發(fā)膝關(guān)節(jié)退行性變。隨著組織工程的發(fā)展，試圖用組織工程化的半月板來修復(fù)損傷。三維支架與種子細胞是組織工程的重要因素。本實驗在前人的基礎(chǔ)上，對半月板軟骨進行脫細胞處理，制備支架，并與骨髓基質(zhì)干細胞進行聯(lián)合培養(yǎng)研究，以期將來可以實現(xiàn)組織工程化膝關(guān)節(jié)的制造。 實驗材料與方法：1.骨髓基質(zhì)干細胞的培養(yǎng)取日本大耳白兔一只(雌雄不

2、限)麻醉后在股骨上部干骺端鉆孔，抽取骨髓，無菌接種到培養(yǎng)瓶中。加人含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。傳至第三代作為種子細胞。 2.豬半月板軟骨脫細胞支架的制備取豬(三月齡)半月板和膝關(guān)節(jié)軟骨修整成1×1cm大小的片狀，用Tris-HCI(PH7.4)緩沖液和TritonX-100脫細胞，將制備的脫細胞軟骨片放人內(nèi)含Tris-HCl(PH7.4)緩沖液中，4℃下保存?zhèn)溆谩?3.兔骨髓基質(zhì)干細胞與豬半月板軟骨脫細胞支架聯(lián)合

3、培養(yǎng)無菌條件下，收集第三代骨髓基質(zhì)干細胞，以反復(fù)滴定法將細胞種植于半月板軟骨脫細胞支架中，在37℃，5％C02，飽和濕度條件下聯(lián)合培養(yǎng)，其后隔日換液。培養(yǎng)7天后觀察。 4.組織學檢查培養(yǎng)至第三代細胞長滿瓶底后，用PBS沖洗三遍，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)三天，取培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)液明膠酶譜分析，用無血清培養(yǎng)液作對比，觀察其中是否含有基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)。分別取正常與脫細胞后的半月板，4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后進行H

4、E染色，改良MASSON染色。分別取脫細胞后的半月板和復(fù)合培養(yǎng)的半月板，2.5％戊二醛固定，作掃描電鏡觀察。 實驗結(jié)果1.干細胞無血清培養(yǎng)液出現(xiàn)一條負染條帶即MMP2帶。無血清培養(yǎng)液無負染帶。 2.HE染色可見脫細胞半月板軟骨內(nèi)無細胞成分，基質(zhì)間空隙較大，且相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。改良MASSON法染色可見脫細胞后半月板軟骨基質(zhì)為綠染，證明留存有大量膠原。 3.電鏡下可見脫細胞后的半月板軟骨支架的孔隙大，孔隙壁不光滑

5、，孔隙直徑20～200μm，孔隙率為80％以上，且孔隙和孔隙之間相互連通，形成三維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。可見與半月板支架結(jié)合良好的骨髓基質(zhì)干細胞，細胞與支架緊密結(jié)合，且伸出偽足，分泌蛋白。細胞數(shù)量較多，長勢良好。 實驗結(jié)論：1.MMP2在骨髓基質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)液中有表達，證明培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細胞有侵襲性，可以和組織工程中的支架材料良好的結(jié)合和生長。 2.脫細胞半月板軟骨支架是半月板軟骨組織工程的理想支架材料。 3.單純脫細