骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合改性的聚羥基烷酸酯構(gòu)建組織工程化半月板的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、半月板無(wú)血運(yùn)區(qū)損傷的修復(fù)是當(dāng)今骨科學(xué)界的難題，組織工程學(xué)修復(fù)是最有前途的修復(fù)方法。軟骨細(xì)胞作為半月板組織工程的種子細(xì)胞，存在體外擴(kuò)增數(shù)量有限以及培養(yǎng)期間容易去分化的缺點(diǎn)，大大限制了其臨床應(yīng)用。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)來(lái)源簡(jiǎn)單，具有多向分化潛能，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等細(xì)胞因子的作用下，可以誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞。而且它具有極強(qiáng)的快速增殖能力，擴(kuò)增后能夠達(dá)到原來(lái)細(xì)胞數(shù)目的10<'10>～10<'20>倍，能夠滿足組織工程種子細(xì)胞

2、數(shù)量的要求。 聚羥基丁酸-羥基戊酸酯(PHBV)是微生物在碳、氧攝取失衡時(shí)合成的產(chǎn)物，它兼?zhèn)渖锊牧虾秃铣刹牧系脑S多優(yōu)點(diǎn)。它具備生物性材料的無(wú)毒、可降解性，降解速度較一般生物材料慢，且又如同常見(jiàn)的合成材料一樣，具有良好的機(jī)械性能。尤其特別的是，它是由聚羥基丁酸(PHB)和聚羥基戊酸(PHV)形成的共聚物，通過(guò)調(diào)整其中PHB和PHV的比例，可調(diào)節(jié)其機(jī)械強(qiáng)度和降解率。 先進(jìn)行PHBV與綿羊BMSCs、軟骨細(xì)胞的生物相容性研究

3、，將BMSCs、軟骨細(xì)胞分別接種在PHBV膜和三維泡沫樣支架上，以掃描電鏡觀察接種后的細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)1h，2h，6h時(shí)的細(xì)胞粘附率；并以接種至培養(yǎng)板上細(xì)胞為對(duì)照組，每日計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線；按培養(yǎng)液量與支架體積10ml/cm<'3>為標(biāo)準(zhǔn)濃度制備浸提液，并制備標(biāo)準(zhǔn)濃度1/16～16倍的浸提液，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性；流式細(xì)胞儀分析接種到材料上的細(xì)胞周期，計(jì)算增殖指數(shù)(PI)；細(xì)胞接種于PHBV三維支架上4、8、12 d，以Hoech

4、st33258熒光法定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA含量，BCA法測(cè)定BMSCs內(nèi)的蛋白質(zhì)含量，二甲基亞甲藍(lán)法測(cè)定軟骨細(xì)胞內(nèi)糖胺聚糖的含量。實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到，BMSCs接種至PHBV膜上2h，軟骨細(xì)胞接種至PHBV膜上6h后，均大部分粘附，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，繪制生長(zhǎng)曲線見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)差異；MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)見(jiàn)9個(gè)濃度梯度的浸提液毒性均為0級(jí)；光、電鏡觀察見(jiàn)細(xì)胞接種于PHBV膜上3d后伸展良好，接種到支架上的細(xì)胞在三維支架的孔隙內(nèi)立體

5、生長(zhǎng)，1周開(kāi)始細(xì)胞問(wèn)連接，3周廣泛連接，分泌大量基質(zhì)；流式細(xì)胞分析見(jiàn)接種于材料上的細(xì)胞周期無(wú)變化；接種到PHBV三維支架上的：BMSCs細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)濃度與對(duì)照組比較無(wú)差異。這些表明，PHBV與BMSCs和軟骨細(xì)胞都有著良好的生物相容性。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，接種到PHBV三維支架上的軟骨細(xì)胞內(nèi)DNA、GAG量明顯高于生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶中的軟骨細(xì)胞，分析認(rèn)為，這可能是由于生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶中的軟骨細(xì)胞是單層培養(yǎng)，培養(yǎng)期間發(fā)生了去分化現(xiàn)象，而生長(zhǎng)在三維支

6、架上的軟骨細(xì)胞則能維持其正常表型。我們也發(fā)現(xiàn)，接種到PHBV膜上1h的BMSCs，1h、2h的軟骨細(xì)胞黏附率都較對(duì)照組有顯著性差異。分析認(rèn)為，這可能是由于PHBV具有高分子合成材料的疏水性特點(diǎn)，表面缺乏親水基團(tuán)，導(dǎo)致細(xì)胞早期不易黏附。因此，對(duì)PHBV進(jìn)行表面改性，以增加其親水性，易于細(xì)胞早期黏附，可能有利于優(yōu)化其作為組織工程材料的性能。 實(shí)驗(yàn)中，以光接枝法對(duì)PHBV進(jìn)行表面改性，將改性前后的PHBV與BMSCs、軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，

7、通過(guò)比較兩種材料上細(xì)胞的黏附率、掃描電鏡觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)以及定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)或GAG的含量，來(lái)分析PHBV經(jīng)過(guò)改性后，是否更有利于細(xì)胞的早期黏附，是否有利于進(jìn)一步增強(qiáng)其生物相容性。結(jié)果顯示，接種到改性后PHBV膜上的BMSCs黏附率分別為：52.7﹪(1h)、74.2﹪(2h)、91.7﹪(6h)，接種后1h BMSCs的黏附率已顯著高于未改性組，與正常培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞黏附率相當(dāng)。接種到改性后PHBV膜上的軟骨細(xì)胞黏附率分別

8、為：47.0﹪(1h)、68.5﹪(2h)、92.5﹪(6h)，接種后1h、2h軟骨細(xì)胞的黏附率已顯著高于未改性組，與正常培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞黏附率相當(dāng)。掃描電鏡見(jiàn)改性后的PHBV膜表面更為粗糙，改性PHBV組的細(xì)胞黏附明顯提前，且細(xì)胞數(shù)多于PHBV組，細(xì)胞分泌基質(zhì)的量亦多于PHBV組。流式細(xì)胞分析顯示兩種材料上生長(zhǎng)的軟骨細(xì)胞、BMSCs細(xì)胞周期無(wú)差異。生長(zhǎng)于兩種材料上的BMSCs內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)的量無(wú)變化，而改性后PHBV支架上的軟骨細(xì)胞內(nèi)D

9、NA、GAG含量顯著增高。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改性后的PHBV更易于細(xì)胞黏附，且具有了更佳的細(xì)胞相容性。 在取得前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以改性的PHBV作為支架材料，應(yīng)用誘導(dǎo)成軟骨分化的綿羊BMSCs作為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建組織工程化半月板。實(shí)驗(yàn)中，將BMSCs接種至改性的PHBV三維泡沫樣支架材料上，以TGF-β、IGF-1聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs向成軟骨分化，培養(yǎng)后的細(xì)胞支架復(fù)合物行掃描電鏡觀察，病理切片番紅O、阿利新藍(lán)染色，Ⅱ型膠

10、原免疫組化染色，細(xì)胞內(nèi)GAG含量測(cè)定。掃描電鏡觀察見(jiàn)誘導(dǎo)后1周，細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形向軟骨細(xì)胞樣的扁平形、圓形轉(zhuǎn)化，細(xì)胞分泌的基質(zhì)亦較BMSCs明顯增加，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種變化更加明顯。細(xì)胞支架復(fù)合物的番紅O、阿利新藍(lán)染色，Ⅱ型膠原免疫組化染色均呈陽(yáng)性，顯示了復(fù)合物已經(jīng)具備了軟骨組織特征性的分泌蛋白多糖和Ⅱ型膠原的能力。細(xì)胞分泌GAG能力的檢測(cè)顯示，誘導(dǎo)后的BMSCs分泌GAG的量顯著增加，但仍低于正常的2代軟骨細(xì)

11、胞。這表明，雖然成軟骨誘導(dǎo)后的BMSCs已具備了軟骨細(xì)胞的特征性功能，但與正常生理功能的軟骨細(xì)胞尚有差距。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證體外構(gòu)建的軟骨樣組織對(duì)于修復(fù)半月板無(wú)血運(yùn)區(qū)損傷的能力，本文的最后一部分，我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物綿羊的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。半月板損傷的模型由延半月板縱軸方向，在其體部無(wú)血運(yùn)區(qū)手術(shù)切開(kāi)而獲得?？紤]到支架材料表面的多孔樣結(jié)構(gòu)可能對(duì)股骨髁、脛骨平臺(tái)面的關(guān)節(jié)軟骨形成磨損，在將體外構(gòu)建的軟骨樣組織植入綿羊半月板損傷處前，先將其埋植

12、于動(dòng)物皮下4周，待其周圍形成肉芽組織包裹后再植入膝關(guān)節(jié)內(nèi)半月板損傷處(D組)。實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)置了半月板損傷后不處理(A組)、單純植入支架(B組)和直接植入體外構(gòu)建的軟骨樣組織(C組)三組，作為對(duì)照。結(jié)果顯示，半月板損傷后不處理和單純植入支架，均不能實(shí)現(xiàn)損傷的修復(fù)；C組的組織直接植入后，半月板損傷雖然得到了修復(fù)，但損傷相對(duì)應(yīng)的股骨髁或脛骨平臺(tái)面關(guān)節(jié)軟骨術(shù)后3月即見(jiàn)不同程度的磨損，6月時(shí)更為顯著；而將體外構(gòu)建獲得組織先埋植皮下4周后再植入半

13、月板損傷后，不但半月板損傷得到了修復(fù)，股骨髁和脛骨平臺(tái)面的軟骨亦得到了較好的保護(hù)，直至術(shù)后6月才出現(xiàn)早期退變的傾向。 總結(jié)全文，得出如下結(jié)論：①PHBV經(jīng)過(guò)光接枝表面改性后，細(xì)胞黏附率得到了提高，細(xì)胞相容性得到了增強(qiáng)。②應(yīng)用改性的PHBV作為支架材料，誘導(dǎo)成軟骨分化的BMSCs為種子細(xì)胞，能夠成功在體外構(gòu)建出軟骨樣組織。③應(yīng)用該組織植入半月板無(wú)血運(yùn)區(qū)的縱形損傷處，能夠修復(fù)半月板損傷。植入前，先埋植于皮下4周，有助于減輕材料對(duì)關(guān)節(jié)