左卡尼汀在腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激損傷中的保護作用研究.pdf

1、腎臟缺血再灌注損傷可發(fā)生于多種疾病情況下,如休克、外科手術(shù)、移植、糖尿病腎病、慢性腎小管-間質(zhì)損傷等,并伴隨著氧化應(yīng)激的增加。氧化應(yīng)激由活性氧介導,包括自由基如超氧陰離子、羥基和非自由基如過氧化氫?；钚匝踉谀I組織中的腎小球、間質(zhì)腎小管、系膜細胞中產(chǎn)生,而組織中的抗氧化防御系統(tǒng)如低分子量抗氧化劑(抗壞血酸素C、谷胱甘肽、維生素E等)、ROS反應(yīng)酶(超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶)以及氧化還原調(diào)節(jié)酶等會同時被激活,抑制活性氧生成并降

2、解活性氧。若活性氧的產(chǎn)生量超過機體自身的清除能力,會同時破壞機體抗氧化酶,通過脂質(zhì)氧化、分解DNA、和蛋白變性等損傷細胞。腎移植過程中移植腎不可避免遭受缺血再灌注損傷,其中主要為氧化應(yīng)激損傷。腎臟冷保存時組織缺氧,移植恢復(fù)血液灌注后即激活瀑布式的炎癥反應(yīng),產(chǎn)生大量活性氧。移植后活性氧的增加可能還參與了慢性移植腎腎病的發(fā)生。活性氧導致的線粒體腫脹,凋亡蛋白酶-3的激活,直接引起細胞壞死或凋亡。在腎臟缺血再灌注損傷后的第一個24小時內(nèi),抗凋

3、亡蛋白Bcl-2家族如Bcl-2和Bcl-XL,以及凋亡前蛋白Bax、p53、FADD和Bak在近曲、遠曲小管的表達均增加,并且與損傷嚴重程度相關(guān)?？寡趸瘎┲委熌軠p輕氧化應(yīng)激,抑制細胞凋亡和壞死,改善移植物保存效果,減輕相關(guān)的損傷和炎癥反應(yīng)。
　　 左卡尼汀(L-carnitine,LC),一種L-賴氨酸的衍生物,是內(nèi)源性的線粒體膜復(fù)合物。人體左卡尼汀的主要生理作用是輔助長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運到線粒體內(nèi)部進入β氧化循環(huán),做為一種營養(yǎng)添加

4、劑已應(yīng)用30余年。左卡尼汀對腎組織的保護作用已經(jīng)在多種氧化應(yīng)激模型中得到證實,如:順鉑導致的腎或小腸損傷模型,慶大霉素引起腎毒性模型,腎的缺血再灌注模型以及慢性腎衰模型。左卡尼汀能抑制腎臟缺血再灌注損傷中血清和腎組織MDA的生成。有學者發(fā)現(xiàn)左卡尼汀有清除DPPH、超氧陰離子、過氧化氫的能力,提高抗氧化酶的活性,如SOD,CAT和GPx等,并能降低腎組織中的MDA濃度。
　　 根據(jù)以上的發(fā)現(xiàn),本研究應(yīng)用人體近曲小管上皮細胞HK-2

5、作為細胞模型,研究左卡尼汀抗氧化作用的分子機制。作為活性氧的主要成員,過氧化氫在氧化還原過程中產(chǎn)生,被認為是引起細胞內(nèi)信號傳遞的信使。過氧化氫能引起脂質(zhì)過氧化和DNA損傷。因此,我們應(yīng)用過氧化氫誘導HK-2細胞氧化應(yīng)激,驗證使用左卡尼汀預(yù)處理能減輕過氧化氫對HK-2的氧化作用。在此基礎(chǔ)上,我們還進一步研究了左卡尼汀在氧化應(yīng)激中ROS的生成,脂質(zhì)過氧化、抗氧化系統(tǒng)、線粒體功能和細胞凋亡情況。
　　 第一章 左卡尼汀對氧化應(yīng)激損傷腎

6、小管上皮細胞的保護作用
　　 目的：建立過氧化氫誘導的人腎小管上皮細胞系(HK-2)氧化應(yīng)激損傷模型,探討左卡尼汀(L-carnitine,LC)對過氧化氫氧化應(yīng)激損傷人腎小管上皮細胞的保護作用及其可能機制。
　　 方法：用不同濃度的H2O2作用于人腎小管上皮細胞(HK-2),四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞活力,建立造成腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激損傷模型；實驗分為5組:正常細胞組、H2O2損傷組、單獨LC組、LC保護組、

7、N-乙酰半胱氨酸(NAC)組,MTT法檢測各組細胞活力,采用酶化學法測定細胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性、以及測定其總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)水平；以氧化敏感的2,7-二氫二氯熒光素(DCFH-DA)染色,熒光顯微鏡觀察及流式細胞儀測定細胞內(nèi)活性氧(ROS)強度,碘化丙啶(PI)染色流式細胞儀測定HK-2細胞的凋亡率。實驗組測量值用均數(shù)±標準差((x)±s)表示

8、,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析,各組比較應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)、組間多重比較應(yīng)用LSD-t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：H2O2500μM×30min處理后HK-2細胞活性較正常細胞顯著降低(P<0.001),單獨應(yīng)用LC 10μM、50μM、100μM處理12小時HK-2細胞活力顯著高于正常對照組(P<0.001),H2O2損傷前使用LC預(yù)處理12小時能抑制H

9、2O2損傷所導致的HK-2細胞活力降低(P<0.001)；H2O2500μM×30min處理后,細胞中SOD,GSH-Px和CAT含量及T-AOC顯著低于正常細胞組(P<0.001),而LC保護組,細胞中SOD,GSH-Px和CAT含量及T-AOC顯著高于H2O2損傷組(P<0.001)；H2O2損傷組MDA、ROS水平高于正常細胞組,細胞凋亡率高于正常細胞組,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.001),而LC保護組MDA、ROS水平以及細胞凋

10、亡率均顯著低于H2O2損傷組(P<0.001)。表明腎小管上皮細胞在經(jīng)左卡尼汀預(yù)處理之后,抗損傷能力加強,損傷程度減少。
　　 結(jié)論：左卡尼汀對氧化應(yīng)激所致的腎小管上皮細胞損傷具有保護作用,其作用機制可能與增強細胞抗氧化能力,減少自由基生成,抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),減少細胞凋亡有關(guān)。
　　 第二章 線粒體通路在左卡尼汀抑制氧化應(yīng)激誘導HK-2細胞凋亡中的作用
　　 目的：探討線粒體通路在左卡尼汀(L-carnitin

11、e,LC)對過氧化氫氧化應(yīng)激致人腎小管上皮細胞凋亡中的作用。
　　 方法：建立H2O2誘導的腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激損傷模型；實驗分為五組:正常細胞組、H2O2損傷組、單獨LC組、LC保護組、N-乙酰半胱氨酸(NAC)組；Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡,計算細胞凋亡率；流式細胞儀檢測線粒體膜電位和半胱天冬酶3(caspase-3)的活性；蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)活性蛋白Bcl-2和Bax的表達以及細胞色素C的釋放。各實

12、驗組測量值用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析,各組比較應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)、組間多重比較應(yīng)用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：Hoechst 33258染色結(jié)果顯示H2O2損傷組出現(xiàn)典型的細胞致密濃染,核固縮、邊緣化等凋亡形態(tài)學改變；H2O2損傷組細胞凋亡率顯著高于正常對照組(P<0.001),不同濃度LC保護組細胞凋亡率顯著低

13、于H2O2損傷組(P<0.001),且該效應(yīng)呈劑量依賴性；使用流式細胞議檢測H2O2損傷組caspase-3活性顯著高于正常對照組(P<0.001),而LC保護組caspase-3活性顯著低于H2O2損傷組(P<0.001)；過氧化氫作用可使HK-2細胞線粒體功能紊亂,H2O2損傷組較正常細胞組線粒體膜電位顯著降低(P<0.001),Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.001),胞漿細胞色素C顯著升高(P<0.001)；而LC保護組較H