Sirt3誘導巨噬細胞線粒體蛋白去乙酰化對巨噬細胞泡沫化影響的研究.pdf

1、目的：研究巨噬細胞線粒體 Sirt3基因的表達對線粒體蛋白去乙?；恼T導作用對巨噬細胞功能的影響，從而探索其與巨噬細胞泡沫化的關系及作用機制，及對動脈粥樣硬化進程的影響。
　　方法：為了提供有說服力的結(jié)果，分別對 Sirt3基因進行干擾與過表達，從正反兩方面進行下列研究：
　　1.構建Sirt3干擾及過表達慢病毒載體。
　　2.以C57BL/6 J小鼠為模型動物，構建Sirt3基因干擾及過表達小鼠模型，并以C57 BL

2、/6J小鼠為對照分組進行高脂與普通飼料飼養(yǎng)，于飼養(yǎng)的0、4及8周采集血樣進行血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、白介素6和 C-反應蛋白的檢測；同時解剖小鼠，取其頸總動脈進行 HE、彈力纖維染色及 Masson染色檢測；以 RT-PCR檢測小鼠頸動脈血管組織Sirt3基因表達，以 WB檢測小鼠頸動脈血管組織 Sirt3蛋白及IDH2蛋白乙?；瘷z測。
　　3.通過腹腔灌洗法收集 C57BL/6J小鼠巨噬細

3、胞，構建 Sirt3基因干擾及過表達巨噬細胞模型，并與 ox-L DL共培養(yǎng)后， RT-PCR檢測 Sirt3基因表達，以 western blotting(WB)檢測Sirt3及乙?；疘D H2蛋白檢測，并以尼羅紅染色流式分析細胞內(nèi)脂質(zhì)含量。
　　結(jié)果：
　　1．干擾及過表達載體構建：以慢病毒為載體，酶切電泳及測序均證實，成功構建了靶向Sirt3的干擾病毒載體GPH-SIRT3-SH2及過表達病毒載體LV5-Sirt3，其

4、滴度均為3×108 TU/ml。
　　2．動物實驗：
　　血清學指標：高脂飼養(yǎng)實驗組血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、白介素6與 C-反應蛋白均高于普通飼料飼養(yǎng)組（p<0.05），提示高脂模型小鼠建模成功。
　　S irt3干擾小鼠經(jīng)高脂飼養(yǎng)后，血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇及白介素6與C-反應蛋白明顯高于正常組及過表達組（p<0.05），但高密度脂蛋白膽固醇無統(tǒng)計學差異（p>0.05）；而過表達

5、組與正常組差異不明顯（p>0.05）；
　　S irt3 mR NA表達及蛋白含量與乙酰化 IDH2含量：干擾組小鼠Sirt3 mRNA表達及蛋白較對正常照小鼠及過表達小鼠明顯降低（p<0.05），乙?；疘DH2蛋白含量增高（p<0.05）；過表達組Sirt3 m RNA表達及蛋白較正常對照組增加（p<0.05），但I DH2蛋白乙?；綗o統(tǒng)計學差異（p<0.05）。
　　血管病理學檢查：HE染色顯示，通過對干擾及過表達正

6、反研究發(fā)現(xiàn)，相同高脂飼養(yǎng)條件下S irt3表達被干擾后，C57BL/6 J小鼠頸動脈血管壁增生明顯；Mas son及彈力纖維染色顯示血管局部膠原纖維增生，彈力纖維退化；而過表達Sirt3則能有效減緩這一病理進程。
　　3、細胞學實驗：
　　巨噬細胞經(jīng)Sirt3慢病毒感染后正反研究顯示：當Sirt3基因表達被干擾后，細胞線粒體IDH2蛋白乙?；潭壬撸欢鳶irt3處于過表達時，IDH2蛋白乙?；潭茸畹?。Sirt3干擾后，巨

7、噬細胞內(nèi)ox-LDL蓄積程度較正常巨噬細胞及過表達組嚴重，而過表達組則少見脂質(zhì)蓄積；
　　結(jié)論：通過動物在體實驗發(fā)現(xiàn) Sirt3在高脂飼養(yǎng)小鼠中表達量的改變后，設計構建以慢病毒為 Sir t3載體進行在體干擾及過表達實驗，探索 Sirt3表達量的改變對高脂飼養(yǎng)小鼠模型的作用。因 Sirt3存在于所有細胞的線粒體中，因此，通過分離巨噬細胞進行體外細胞學實驗，對巨噬細胞線粒體中 Sirt3進行干擾及過表達，研究其對巨噬細胞生理功能的影