中間錦雞兒油酸脫氫酶基因（CaFAD2）克隆與功能鑒定.pdf

1、木本植物油脂資源豐富，是制造生物柴油的重要原料。提高單不飽和脂肪酸含量，是改善植物油脂品質(zhì)，改良油脂植物，降低生物柴油成本的關(guān)鍵。同時，脂肪酸也是植物細(xì)胞膜組成的重要部分，對于維持植物正常的生長發(fā)育和抗逆能力至關(guān)重要。利用基因工程手段改變油脂植物的脂肪酸成分，提高木本油料植物單不飽和脂肪酸比例，是創(chuàng)制抗逆性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)生物柴油原料植物的重要途徑。油酸脫氫酶(油酰磷脂酰膽堿去飽和酶，F(xiàn)AD2)催化油酸脫氫合成亞油酸，調(diào)控多不飽和脂肪酸合成，是

2、植物脂肪酸代謝過程中的關(guān)鍵元素。因此研究該酶基因的結(jié)構(gòu)與功能，揭示其調(diào)控脂肪酸代謝的機(jī)理，探索表達(dá)調(diào)控方式和時空變化具有重要的理論和實際意義，但是，迄今有關(guān)木本油料植物脂肪酸合成分子生物學(xué)研究較少。 本研究應(yīng)用分子生物學(xué)手段，從木本油料植物—中間錦雞兒(Caragana intermedia)中克隆獲得尉D2基因(CaFAD2)，利用生物信息學(xué)分析研究了CaFAD2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，成功構(gòu)建了該基因的反義表達(dá)和正義表達(dá)載體，利

3、用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得脂肪酸不飽和度明顯改變的轉(zhuǎn)基因煙草株系，結(jié)合表型、生理生化和分子生物學(xué)對轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行了綜合分析，驗證分析了CaFAD2基因的功能。 1、利用RT-PCR和RACE方法，從中間錦雞兒莖葉中克隆了CaFAD2基因cDNA的全長序列(Genebank No．AY957393)，并驗證分析了其功能，為中間錦雞兒遺傳改良提供了試驗和技術(shù)基礎(chǔ)。 2、生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CaFAD2基因編碼區(qū)全長為

4、1053bp，編碼350個氨基酸。所編碼的蛋白質(zhì)與大豆、芝麻、蓮的FAD2同源性均達(dá)到80％以上；與擬南芥、煙草、油菜的同源性高于70％，屬于油酸脫氫酶類。推測該蛋白質(zhì)酶具有脂肪酸去飽和酶的6個跨膜區(qū)域和3個組氨酸保守區(qū)域。 3、定量PCR檢測結(jié)果表明，CaFAD2基因在中間錦雞兒莖和葉中都有表達(dá)，但在不同器官中表達(dá)模式不同，葉中表達(dá)量高于莖中。 4、利用CaFAD2基因保守區(qū)域片段構(gòu)建成功CaFAD2基因反義表達(dá)載體，

5、通過根癌農(nóng)桿菌系統(tǒng)導(dǎo)入煙草，篩選獲得CaFAD2基因抑制程度不同的陽性轉(zhuǎn)基因煙草株系RTC0系。與對照煙草相比，轉(zhuǎn)CaFAD2基因煙草葉片和種子總脂中多不飽和脂肪酸含量分別降低約20％和10％，而油酸含量分別升高約16％和7％，說明CaFAD2基因在煙草能夠反義表達(dá)，抑制煙草內(nèi)源FAD2基因表達(dá)。 5、成功構(gòu)建了CaFAD2基因全長正義表達(dá)載體，并利用根癌農(nóng)桿菌表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化煙草，獲得陽性轉(zhuǎn)CaFAD2全長基因的煙草株系TC0系

6、。開展了轉(zhuǎn)基因煙草和對照煙草低溫過冬(8-12℃)培養(yǎng)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照煙草存活率(20％)明顯低于轉(zhuǎn)基因煙草TC0系(90％)。 6、RT-PCR檢測和脂肪酸分析結(jié)果顯示，CaFAD2全長基因在TC0系煙草中能夠表達(dá)，提高煙草中FAD2基因表達(dá)量，促進(jìn)了多不飽和脂肪酸合成，轉(zhuǎn)基因陽性煙草種子和葉片中多不飽和脂肪酸分別增加了7.77％和10.96％。 7、通過生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)結(jié)合方式，探索分析了CaFAD2基因和

7、SoyFAD2基因結(jié)構(gòu)和功能差異。兩個基因均來自莖葉，編碼的蛋白質(zhì)氨基酸同源性達(dá)90％，具有3個組氨酸保守區(qū)和6個跨膜區(qū)，但是前者氨基酸比后者少33個，組氨酸和跨膜區(qū)位置也有所不同。轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)，CaFAD2基因和SoyFAD2基因在煙草中均能正義表達(dá)，促使煙草種子和葉片中多不飽和脂肪酸含量增加，CaFAD2正義表達(dá)促進(jìn)作用高于SoyFAD2，但是差異不顯著。CaFAD2和SoyFAD2基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，可能存在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后