預(yù)測(cè)環(huán)境因子潛在致癌性方法的探討.pdf

1、癌癥已是人類健康的最大威脅之一，盡管其發(fā)生、形成機(jī)理仍未被完全闡明，但大部分癌癥由環(huán)境因子引發(fā)已屬共識(shí)。某些環(huán)境因子引起細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體表達(dá)水平的改變，從而激發(fā)、增加DNA突變率并導(dǎo)致癌細(xì)胞的發(fā)生。因此，通過檢測(cè)環(huán)境因子對(duì)DNA突變率的激發(fā)結(jié)果來估計(jì)其誘發(fā)癌癥的可能性已成為一項(xiàng)重要的研究?jī)?nèi)容。從數(shù)學(xué)分析方法上來看，它屬于統(tǒng)計(jì)推斷范疇，即由一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果、數(shù)據(jù)來估計(jì)、推斷隨機(jī)事件發(fā)生的可能性；而正確的檢測(cè)、分析方法則是降低推斷分析中“

2、以真作假”和“以假作真”等錯(cuò)誤機(jī)率的關(guān)鍵。 Ames測(cè)試是通過檢測(cè)化合物能否增加組氨酸缺陷型沙門氏菌的回復(fù)突變來推測(cè)其潛在致癌性，該測(cè)試對(duì)化合物的致突變性、潛在致癌性易于測(cè)試、判斷；但對(duì)于含組氨酸的復(fù)雜混合物，經(jīng)典的Ames測(cè)試并不適合，檢測(cè)、分析方法的不當(dāng)即會(huì)造成“以假作真”的錯(cuò)誤推斷。近年來，在檢測(cè)中藥制劑的致突變性時(shí)，這一問題又恰恰發(fā)生了；當(dāng)然，這類問題同樣存在于用Ames測(cè)試來檢測(cè)其它復(fù)雜混合物的致突變性時(shí)。 不

3、久前，國(guó)家發(fā)展改革委發(fā)布了《高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化“十一五”規(guī)劃》，規(guī)劃提出在“十一五”期間我國(guó)將實(shí)施16個(gè)高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化重大專項(xiàng)，其中包括“現(xiàn)代中藥”重大專項(xiàng)。然而，能否準(zhǔn)確地檢測(cè)、評(píng)定中藥的致突變性、潛在致癌性會(huì)直接影響國(guó)家對(duì)中藥產(chǎn)業(yè)的政策，同時(shí)也關(guān)系到中藥能否被充分利用，更是關(guān)系到人類健康的頭等大事。因此，建立一個(gè)適于分析復(fù)雜混合物致突變性的方法就顯得尤為迫切和重要。 以表型為檢測(cè)指標(biāo)的突變檢測(cè)方法往往會(huì)受到多種因素的影響，同時(shí)環(huán)境因

4、子對(duì)DNA的致突變作用也絕不僅僅局限于某個(gè)特定的基因(如Ames測(cè)試中組氨酸操縱子的某個(gè)基因)，這涉及到隨機(jī)性還是特異性的問題，這一點(diǎn)在理論上至今還沒有確切的答案；而直接以DNA為檢測(cè)指標(biāo)的突變檢測(cè)方法應(yīng)是解決這類問題的關(guān)鍵所在。本論文的相關(guān)研究工作即在上述背景下展開，三年來取得了以下研究成果。 一、對(duì)影響Ames測(cè)試結(jié)果不確定性因素的分析 Ames測(cè)試是目前各個(gè)實(shí)驗(yàn)室普遍采用的檢測(cè)環(huán)境來源的致突變物、潛在致癌物的通用初

5、篩方法之一，但該測(cè)試在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)過程及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析上仍存在一些不確定性的因素和疑問。評(píng)估一個(gè)微生物群體的自發(fā)突變率和誘發(fā)突變率在遺傳理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上都是一個(gè)涉及多方面因素的復(fù)雜性難題，估計(jì)誘發(fā)突變率時(shí)涉及到對(duì)兩個(gè)正態(tài)分布的混合分布參數(shù)的估計(jì)，它需要大量的樣本，但Ames測(cè)試中樣本數(shù)均較小，無法用條件矩等方法估計(jì)混合分布的參數(shù)；DNA發(fā)生突變的隨機(jī)性和誘發(fā)因素的相關(guān)性也是尚未闡明的難題之一。 1.1 總體上來說，Ames測(cè)試

6、菌株只能檢測(cè)出導(dǎo)致小規(guī)模突變的致突變物和理化因子，對(duì)于更多其它類型的致突變物和理化因子則無法檢出，這就導(dǎo)致了該測(cè)試在有效檢出的致突變物類型及種類上存在較大的局限性，且易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 1.2 Ames測(cè)試菌株只能檢測(cè)出發(fā)生在特定位點(diǎn)上的突變，發(fā)生在其它位點(diǎn)上的突變則無法檢出。 1.3 Ames測(cè)試建立在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基上，當(dāng)用其檢測(cè)復(fù)雜混合物如中藥的致突變性時(shí)，可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，適應(yīng)性突變更加劇了這種可能性。

7、 1.4 Ames測(cè)試中可統(tǒng)計(jì)的回復(fù)子菌落數(shù)是培養(yǎng)時(shí)間的函數(shù)，肉眼可見的回復(fù)子菌落數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，人為規(guī)定的48h或其它時(shí)間是一個(gè)“約定俗成”的慣例，缺乏其應(yīng)具有的科學(xué)內(nèi)涵。 1.5 Ames測(cè)試中各類型的回復(fù)子在選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率各不相同。在統(tǒng)計(jì)時(shí)，相當(dāng)數(shù)量的生長(zhǎng)慢的回復(fù)子因未能形成肉眼可見的回復(fù)子菌落而不能被統(tǒng)計(jì)，這也是Ames測(cè)試這類基于試驗(yàn)組與對(duì)照組間回復(fù)子菌落數(shù)差異的大小來判定物質(zhì)致突變性的檢測(cè)方法的致命

8、缺陷之一。 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使直接以DNA為檢測(cè)指標(biāo)的物質(zhì)致突變性檢測(cè)方法得以實(shí)現(xiàn)，其可避免Ames測(cè)試中較多不確定性因素和結(jié)果。 二、建立了一個(gè)檢測(cè)中藥制劑潛在致癌性的方法 Ames測(cè)試建立在含微量組氨酸的固體培養(yǎng)基上，要求試驗(yàn)組與對(duì)照組中組氨酸含量相同，以使得試驗(yàn)組與對(duì)照組中測(cè)試菌的分裂次數(shù)、生長(zhǎng)量均趨于相同。該測(cè)試在檢測(cè)中藥致突變性時(shí)，因受中藥中組氨酸含量的影響，試驗(yàn)組中組氨酸含量高于對(duì)照組而使對(duì)照組失

9、去了可比性，致使多種中藥在該測(cè)試中呈陽性。本研究用Ames測(cè)試檢測(cè)了7種中藥的致突變性，所有測(cè)試的中藥均呈陽性。 Ames測(cè)試菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)量及瞬時(shí)生長(zhǎng)速率不受培養(yǎng)基中組氨酸濃度的影響；處于衰亡期的Ames測(cè)試菌株TA100和TA98的相對(duì)回復(fù)突變頻率與測(cè)試體系中誘變劑的濃度間存在劑量效應(yīng)關(guān)系?；谏鲜龅慕Y(jié)果，建立一個(gè)根據(jù)試驗(yàn)組與對(duì)照組中衰亡期的測(cè)試菌的相對(duì)回復(fù)突變頻率的差異性來評(píng)定物質(zhì)致突變性的方法。中藥所含

10、的組氨酸不會(huì)影響該測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，因而適于檢測(cè)中藥的致突變性，進(jìn)而推斷中藥的潛在致癌性。 通過測(cè)定中藥中組氨酸含量并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證實(shí)這些中藥的“致突變性”源于中藥所含組氨酸導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。應(yīng)用新建方法測(cè)定了在Ames測(cè)試中呈“陽性”中藥的致突變性，在該測(cè)試中試驗(yàn)組中測(cè)試菌的相對(duì)回復(fù)突變頻率與中藥濃度間不存在劑量效應(yīng)關(guān)系，并且試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組中測(cè)試菌的相對(duì)回復(fù)突變頻率無顯著性差異(t-test；p<0.05)，說明這些中

11、藥在該測(cè)試中呈陰性，即沒有致突變性，進(jìn)而推斷這些中藥沒有潛在致癌性。 三種中藥(銀杏葉、貓眼草、三棱)進(jìn)行了哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，結(jié)果顯示所測(cè)試中藥均無致突變性，該測(cè)試結(jié)果進(jìn)一步佐證了新建方法檢測(cè)中藥致突變性的有效性，也說明該方法適于評(píng)價(jià)中藥的潛在致癌性。 三、改進(jìn)了應(yīng)用MutS蛋白檢測(cè)突變的方法 MutS蛋白在體外能識(shí)別并結(jié)合含有錯(cuò)配堿基的DNA片段，多種基于此屬性的突變檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生。本文中實(shí)驗(yàn)結(jié)

12、果證實(shí)，MutS蛋白在高劑量下亦能很好地結(jié)合純合雙鏈DNA，并且這種結(jié)合具有劑量依賴性；在低劑量下，MutS蛋白結(jié)合雜合雙鏈DNA的能力顯著強(qiáng)于其對(duì)純合雙鏈DNA的結(jié)合。 本研究中摒棄了測(cè)序法和代表性差異分析法，而采用能有效區(qū)別樣品間DNA量的微小差異的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)來檢測(cè)突變，直接比較實(shí)驗(yàn)樣品與對(duì)照樣品的Ct值的差異來判斷、檢測(cè)突變。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)突變的過程。 另外，證實(shí)了用此種方法

13、能夠檢測(cè)在背景細(xì)胞中低至2％的突變體，是一種改進(jìn)的、簡(jiǎn)便的、在DNA水平上檢測(cè)突變的方法。 四、極低比例的未知突變體檢測(cè)方法的探討及初步建立 多種檢測(cè)DNA片段多態(tài)性和突變的方法例如測(cè)序法及單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)只能檢測(cè)出群體中高比例的突變體(>9％)，對(duì)于更低比例的突變體則無法有效檢出。 用于檢測(cè)低比例的突變體的方法需要具有高分辨力和高靈敏度，目前滿足這兩個(gè)條件的檢測(cè)方法如芯片、生物電極等又因成本過高而難以

14、被普遍地應(yīng)用。本文設(shè)計(jì)了一個(gè)可提高群體中極低比例的突變體的相對(duì)及絕對(duì)含量的PCR程序，應(yīng)用此程序提高了突變體的相對(duì)及絕對(duì)含量后，用激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析了實(shí)驗(yàn)樣品及對(duì)照樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在毛細(xì)管電泳譜圖中，實(shí)驗(yàn)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物比對(duì)照樣品明顯地多出了一個(gè)峰，此峰是實(shí)驗(yàn)樣品中極低比例的未知突變體(10-5)經(jīng)擴(kuò)增后被檢測(cè)到。此方法具有一定的可行性，但還需進(jìn)一步優(yōu)化條件以提高突變體的檢出效率，在此基礎(chǔ)上