飲用水中碘乙酸和碘仿的檢測(cè)識(shí)別、遺傳毒性和潛在致癌性研究.pdf

1、碘系消毒副產(chǎn)物是飲用水消毒過(guò)程中新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)未受控消毒副產(chǎn)物。原水碘離子含量高和氯胺消毒是形成碘系消毒副產(chǎn)物的重要直接因素。上海市地處長(zhǎng)江入?？?水源水質(zhì)易受咸潮影響,而且多數(shù)水廠以常規(guī)水處理工藝(預(yù)氧化、混凝、沉淀、沙濾和消毒)生產(chǎn)飲用水,特殊的環(huán)境條件和所采用飲用水加工工藝易于形成碘系消毒副產(chǎn)物。盡管飲用水中碘系消毒副產(chǎn)物含量低至納克,但毒性極大。有研究表明碘系消毒副產(chǎn)物比受控的消毒副產(chǎn)物具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性和遺傳毒性,因此,本研究以

2、上海市飲用水加工過(guò)程中代表性的碘系消毒副產(chǎn)物(碘乙酸和碘仿)的生成水平和影響因素為切入點(diǎn),通過(guò)檢測(cè)飲用水中碘乙酸和碘仿含量,了解人群碘乙酸和碘仿的暴露水平;利用四噻唑藍(lán)試驗(yàn)、CCK-8試驗(yàn)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX含量測(cè)定和胞質(zhì)分裂阻滯法微核試驗(yàn)等系列組合實(shí)驗(yàn)研究碘乙酸和碘仿的細(xì)胞毒性和遺傳毒性特征及它們可能的作用機(jī)制;繼而通過(guò)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究碘乙酸和碘仿的潛在致癌性及可能機(jī)制。研究結(jié)果將為今后上海市不同水源消

3、毒副產(chǎn)物的過(guò)程控制,制水工藝的升級(jí)改進(jìn)提供重要的科學(xué)依據(jù),也為碘乙酸和碘仿健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和飲用水水質(zhì)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的研制奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分，上海市飲用水中碘乙酸和碘仿的檢測(cè)識(shí)別
　　1、飲用水中氯、溴和碘離子檢測(cè)方法的建立
　　本研究在借鑒美國(guó)環(huán)保局推薦的300.1方法基礎(chǔ)上,建立基于離子色譜法測(cè)定飲用水中氯和溴離子的檢測(cè)方法;通過(guò)質(zhì)譜對(duì)碘化衍生物進(jìn)行精確定性,繼而建立基于氣相色譜電子捕獲檢測(cè)器測(cè)定水中碘離子的檢測(cè)方法。

4、離子色譜分析結(jié)果顯示,氯離子和溴離子分離度良好,峰形對(duì)稱,無(wú)拖尾,溶劑和雜質(zhì)峰干擾少,整個(gè)色譜分析歷時(shí)12min。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量,氯離子與溴離子的方法線性范圍分別為1～1000mg/L和1～1000μg/L,確定系數(shù)均為0.999。平均加標(biāo)回收率在89.7％～112.3％之間,精密度小于2.9％,氯離子和溴離子方法檢出限分別為55.6和0.37μg/L。連續(xù)校準(zhǔn)值為87.9％～113.2％,替代物響應(yīng)值為93.2％～103.4％

5、,平行雙樣測(cè)定的相對(duì)偏差在0.0％～8.0％。含碘物質(zhì)經(jīng)衍生化后,質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)碘離子衍生化后生成碘代丁酮存在2個(gè)同分異構(gòu)體,即1-碘-2-丁酮和3-碘-2-丁酮。采用雙毛細(xì)管柱定性分析顯示,碘代丁酮分離度好,整個(gè)色譜分析歷時(shí)19.33min。選擇響應(yīng)值較高的3-碘-2-丁酮進(jìn)行定量檢測(cè),方法線性范圍為1～100μg/L,確定系數(shù)r2=0.999;方法檢出限為0.13μg/L;平均加標(biāo)回收率為102.0％,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1％,連續(xù)校準(zhǔn)

6、值在97.2％～108.8％,內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值在92.00％～110.05％,平行雙樣測(cè)定的相對(duì)偏差在4.4％～11.6％。研究結(jié)果表明所建立的氯、溴和碘離子的檢測(cè)方法靈敏度高,定性定量準(zhǔn)確,質(zhì)量控制符合美國(guó)EPA檢測(cè)方法的要求,適用于水中微量氯離子、溴離子和碘離子的分析。
　　2、氣相色譜電子捕獲檢測(cè)器法測(cè)定飲用水中碘乙酸、碘仿、4種三鹵甲烷和9種鹵乙酸
　　借鑒美國(guó)環(huán)保局推薦的檢測(cè)方法551.1和552.3,經(jīng)優(yōu)化前處理和檢

7、測(cè)條件,建立基于雙柱定性氣相色譜電子捕獲檢測(cè)器法測(cè)定飲用水中碘乙酸、碘仿、4種三鹵甲烷(氯仿、溴仿、二氯一溴甲烷、二溴一氯甲烷)和9種鹵乙酸(氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、溴乙酸、二溴乙酸、三溴乙酸、二氯一溴乙酸、二溴一氯乙酸、溴氯乙酸)的檢測(cè)方法。氣相色譜電子捕獲檢測(cè)器法檢測(cè)結(jié)果顯示,碘乙酸、碘仿、4種三鹵甲烷和9種鹵乙酸分離度好,峰形對(duì)稱,無(wú)拖尾,溶劑和雜質(zhì)峰干擾少,基線平穩(wěn)。碘仿和4種三鹵甲烷整個(gè)色譜分離時(shí)間為40.67min,而碘

8、乙酸和9種鹵乙酸整個(gè)色譜分離時(shí)間為23.50min。采用內(nèi)標(biāo)工作曲線法定量,碘乙酸和碘仿的方法線性范圍分別為0.01～2.5μg/L和0.05～5μg/L,4種三鹵甲烷和9種鹵乙酸的方法線性范圍均為1～100μg/L,確定系數(shù)均大于0.994。碘乙酸、碘仿、4種三鹵甲烷和9種鹵乙酸的平均加標(biāo)回收率在93.5％～111.1％之間,精密度小于7.0％。碘乙酸和碘仿的方法檢測(cè)限分別為6.2和17.7ng/L,4種三鹵甲烷和9種鹵乙酸的方法檢測(cè)

9、限為191.4～502.2ng/L。碘乙酸、碘仿、4種三鹵甲烷和9種鹵乙酸的連續(xù)校準(zhǔn)值在87.1％～114.0％,內(nèi)標(biāo)物平均響應(yīng)值在85.2％～120.0％,替代物響應(yīng)值在85.8％～116.5％,平行雙樣測(cè)定的相對(duì)偏差在0.1％～10.3％。改進(jìn)后的碘乙酸、碘仿、4種三鹵甲烷和9種鹵乙酸測(cè)定方法分離度好、分析時(shí)間短、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。儀器條件簡(jiǎn)單,可自動(dòng)化批量處理,適合于普通實(shí)驗(yàn)室分析。
　　3、上海市飲用水中碘乙酸

10、和碘仿的污染現(xiàn)狀研究
　　為了解上海市以長(zhǎng)江和黃浦江為水源水廠各工藝環(huán)節(jié)水中碘乙酸和碘仿的水平,評(píng)價(jià)水源水質(zhì)、生產(chǎn)工藝、消毒劑種類(lèi)對(duì)碘乙酸和碘仿形成的影響,本研究以上海市中心城區(qū)13家水廠(11家水廠采用常規(guī)生產(chǎn)工藝,2家采用深度處理工藝)為對(duì)象,分別于枯水期和豐水期采集水廠不同工藝過(guò)程水樣,測(cè)定水樣的pH值、氨氮、可溶性有機(jī)碳、UV254、特征紫外吸光度、氯離子、溴離子、碘離子、碘乙酸、碘仿、4種三鹵甲烷和9種鹵乙酸的水平生成和

11、變化情況。
　　研究結(jié)果顯示,黃浦江和長(zhǎng)江水質(zhì)呈弱堿性(pH=7.34),氨氮含量小于0.5mg/L,有機(jī)物含量未見(jiàn)偏高,DOC、UV254和SUVA的中位數(shù)分別為6.00mg/L、0.231/cm、3.90L/(mg·m)。黃浦江pH值稍低于長(zhǎng)江,豐水期高于枯水期;豐水期黃浦江和長(zhǎng)江的氨氮濃度相近,枯水期黃浦江的氨氮含量高于長(zhǎng)江。黃浦江可溶性有機(jī)碳和UV254含量均高于長(zhǎng)江,其中兩江可溶性有機(jī)碳含量豐水期略高于枯水期,而兩江UV

12、254含量則是豐水期低于枯水期;黃浦江的特征紫外吸光度水平在豐水期稍高于長(zhǎng)江,枯水期則低于長(zhǎng)江:黃浦江氯、溴和碘離子高于長(zhǎng)江,且豐水期低于枯水期。各水廠出廠水碘乙酸和碘仿含量在0.03～1.66μg/L。9種鹵乙酸和4種三鹵甲烷含量范圍在0.28～63.74μg/L。以黃浦江為原水的水廠出廠水中碘乙酸和碘仿含量高于以長(zhǎng)江為原水的水廠,而豐水期又低于枯水期。多元線性回歸分析結(jié)果顯示,pH值與碘乙酸和碘仿的形成呈負(fù)相關(guān),碘仿的形成還與UV2

13、54和碘離子水平呈正相關(guān)。
　　氯胺預(yù)氧化較臭氧產(chǎn)生更多的碘乙酸和碘仿,濃度范圍在0.2～1.7μg/L,而與液氯預(yù)氧化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各水廠生產(chǎn)工藝對(duì)水質(zhì)pH值、氨氮、可溶性有機(jī)碳、氯離子、溴離子濃度影響不大,但UV254、特征紫外吸光度水平明顯下降。常規(guī)生產(chǎn)工藝水廠的出廠水中碘離子濃度明顯下降。未在原水中發(fā)現(xiàn)碘乙酸和碘仿,但各水廠出廠水均檢出碘乙酸和碘仿。常規(guī)生產(chǎn)工藝可形成碘乙酸、碘仿、9種鹵乙酸和4種三鹵甲烷;深度處理工

14、藝在活性炭工藝前均未檢出碘乙酸和碘仿,但可檢出微量9種鹵乙酸和4種三鹵甲烷。上述結(jié)果表明上海市主城區(qū)各水廠的出廠水中均檢出碘乙酸和碘仿,含量處于納克至微克水平。低pH值、高有機(jī)物、高碘離子及以氯胺預(yù)氧化有利于形成碘乙酸和碘仿。常規(guī)和深度處理工藝對(duì)水質(zhì)pH值、氨氮、可溶性有機(jī)碳、氯離子和溴離子影響不大,不能有效去除飲用水加工過(guò)程生成的碘乙酸和碘仿。
　　第二部分，碘乙酸和碘仿的細(xì)胞毒性研究
　　采用一組不同細(xì)胞毒性終點(diǎn)的試驗(yàn)研

15、究碘乙酸和碘仿的細(xì)胞毒性及其可能的作用機(jī)制。分別以不同劑量的碘乙酸和碘仿對(duì)NIH/3T3細(xì)胞染毒72h后,以四噻唑藍(lán)試驗(yàn)測(cè)定碘乙酸對(duì)NIH/3T3細(xì)胞增殖和線粒體損傷的影響,以CCK-8試驗(yàn)測(cè)定碘仿對(duì)NIH/3T3細(xì)胞增殖和線粒體損傷的影響;并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;測(cè)定碘乙酸和碘仿對(duì)細(xì)胞乳酸脫氫酶、ATP、還原型谷胱甘肽含量的影響;以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡的改變。研究結(jié)果顯示,碘乙酸和碘仿染毒72h后可導(dǎo)致NIH/3T3

16、細(xì)胞存活率下降,呈劑量-反應(yīng)關(guān)系;碘乙酸的細(xì)胞毒性分別比溴乙酸和氯乙酸強(qiáng)2、218倍,碘仿的細(xì)胞毒性比溴仿強(qiáng)81倍。碘乙酸和碘仿染毒72h后,光鏡下觀察到細(xì)胞增殖受抑制,出現(xiàn)細(xì)胞凋亡或壞死現(xiàn)象:還可引起細(xì)胞外乳酸脫氫酶含量上升和細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降(P＜0.05),并呈劑量.反應(yīng)關(guān)系;對(duì)細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱肽無(wú)明顯影響(P＞0.05)。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,碘乙酸和碘仿可分別導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死比例增多,碘乙酸可使細(xì)胞出現(xiàn)S期阻滯,而碘仿則

17、使細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯。研究結(jié)果表明,碘乙酸和碘仿產(chǎn)生細(xì)胞毒性可能與線粒體損傷、ATP耗竭和胞膜損傷有關(guān)。線粒體途徑可能是碘乙酸和碘仿致細(xì)胞死亡的機(jī)制之一。而碘乙酸和碘仿致細(xì)胞周期阻滯提示碘乙酸和碘仿可損傷細(xì)胞DNA。
　　第三部分，碘乙酸和碘仿的遺傳毒性研究
　　應(yīng)用鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX含量測(cè)定和胞質(zhì)分裂阻滯法微核試驗(yàn)評(píng)價(jià)碘乙酸和碘仿的遺傳毒性。分別以不同劑量的碘乙酸和碘仿對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA1

18、00和TA98菌株進(jìn)行染毒,其中碘乙酸采用非預(yù)培養(yǎng)法和預(yù)培養(yǎng)法,碘仿采用非預(yù)培養(yǎng)法,均培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)鼠傷寒沙門(mén)氏菌回變菌落數(shù)。先通過(guò)NIH/3T3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線確定碘乙酸和碘仿的染毒時(shí)間,再以CCK-8試驗(yàn)明確碘乙酸和碘仿的染毒劑量,最后采用胞質(zhì)分裂阻滯法微核試驗(yàn)測(cè)定不同劑量碘乙酸和碘仿染毒40h后誘導(dǎo)細(xì)胞微核形成數(shù)。先以CCK-8試驗(yàn)確定碘乙酸和碘仿染毒24h后的染毒劑量,繼而以流式細(xì)胞儀測(cè)定不同劑量碘乙酸和碘仿染毒24h后NIH/3

19、T3細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)量。結(jié)果顯示,碘乙酸在加或不加S9條件下均未能誘導(dǎo)鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA100和TA98回復(fù)菌落數(shù)顯著增加;碘仿在加或不加S9條件下均可誘導(dǎo)鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA100和TA98回復(fù)菌落數(shù)顯著增加。碘乙酸可引起NIH/3T3細(xì)胞γ-H2AX含量增加,并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系;碘仿能引起NIH/3T3細(xì)胞γ-H2AX含量增加,但未見(jiàn)劑量.反應(yīng)關(guān)系。碘乙酸和碘仿均未能引起NIH/3T3細(xì)胞微核形成率增加。鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

20、、微核試驗(yàn)和γ-H2AX含量測(cè)定試驗(yàn)表明碘乙酸和碘仿為可疑遺傳毒物。
　　第四部分，碘乙酸和碘仿的潛在致癌性研究
　　應(yīng)用體外細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)研究碘乙酸和碘仿的潛在致癌性及其可能的作用機(jī)制。先通過(guò)細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)確定細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的染毒劑量,然后以不同劑量的碘乙酸和碘仿對(duì)NIH/3T3細(xì)胞染毒72h后繼續(xù)培養(yǎng)10天,觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶形成數(shù)。繼而以伴刀豆蛋白A凝集試驗(yàn)、軟瓊脂試驗(yàn)和裸鼠成瘤試驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡變情況,并以流式細(xì)

21、胞儀分析惡性轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的周期變化,以免疫細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)分析惡性轉(zhuǎn)化后細(xì)胞p53蛋白表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示,碘乙酸可誘導(dǎo)NIH/3T3細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化細(xì)胞能引起伴刀豆蛋白A凝集,可在軟瓊脂中形成克隆,并能在裸鼠皮下形成腫瘤,腫瘤組織學(xué)檢查表明所形成腫瘤為分化程度較低的纖維肉瘤。細(xì)胞周期分析顯示轉(zhuǎn)化細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯,S期和G2/M期細(xì)胞比例下降。免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示p53蛋白表達(dá)未見(jiàn)增強(qiáng)。而碘仿在體外NIH/3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化試