丙烯酰胺及遺傳毒性致癌機(jī)制的研究.pdf

1、本研究以整體動物和體外培養(yǎng)細(xì)胞作為受試系統(tǒng)，就丙烯酰胺對實(shí)驗(yàn)動物和體外哺乳動物細(xì)胞遺傳毒性致癌機(jī)制進(jìn)行了研究。 目的和內(nèi)容： 1、以F344雌雄大鼠為模型，給予不同劑量的AA6個月，以細(xì)胞增殖、DNA損傷、病理改變?yōu)橹虚g終點(diǎn)，觀察AA對大鼠的致癌效應(yīng)，同時以K-ras為靶基因探討AA致癌作用的機(jī)制； 2、以CHL細(xì)胞為對象，研究不同劑量組AA及其代謝產(chǎn)物環(huán)氧丙烯酰胺(GA)對體外培養(yǎng)的CHL細(xì)胞：DNA損傷和染色

2、體畸變率的影響，在體外環(huán)境中探討丙烯酰胺是否具有獨(dú)立的遺傳毒性及其機(jī)制。 方法： 1、動物試驗(yàn)：①實(shí)驗(yàn)動物分組及處理：8周齡F344大鼠80只，按性別及體重隨機(jī)分為1個陰性對照組和3個劑量組，參考人群食物中AA平均攝入量水平，分別以蒸餾水、0.25mg/kg bw/day、1.0mg/kg bw/day和2.0mg/kg bw/day的AA灌胃6個月后宰殺，取腦、甲狀腺、肺、肝、腎、腎上腺、結(jié)腸、睪丸(雄)以及乳腺(雌)

3、等組織器官；②觀察指標(biāo)：a．一般生長發(fā)育指標(biāo)：a．體重增長以及臟器重量；b．細(xì)胞．Brdu標(biāo)記指數(shù)(LI)：免疫組織化學(xué)染色法測定肝、腎、肺、腎上腺、甲狀腺、結(jié)腸、睪丸(雄)和乳腺(雌)等組織的細(xì)胞：Brdu標(biāo)記指數(shù)；c．DNA損傷情況：單細(xì)胞凝膠電泳法(彗星實(shí)驗(yàn))測定肝、腎、腎上腺、肺、結(jié)腸和睪丸(雄)等組織的：DNA損傷； d．K-Ras蛋白表達(dá)：Westem blot法測定肝、腎、腎上腺、肺、結(jié)腸、睪丸(雄)等組織K-Ras蛋白的

4、表達(dá)；e．病理形態(tài)學(xué)改變：腦、肝、腎、肺、腎上腺、甲狀腺、結(jié)腸、睪丸(雄)和乳腺(雌)等臟器的形態(tài)學(xué)改變。 2、體外試驗(yàn)：①CHL細(xì)胞存活率的測定：MTT試驗(yàn)，以確定AA和GA在彗星試驗(yàn)和染色體畸變試驗(yàn)中的受試濃度：②CHL細(xì)胞DNA損傷：體外CHL細(xì)胞培養(yǎng)，分別加入0.1mM，0.2mM，0.4mM，0.8mM，1.0mM，2.0mM，4.0mM和6.0mM的AA及相同濃度的GA培養(yǎng)6、12及24小時，采用單細(xì)胞凝膠電泳法比較

5、不同濃度和不同時間點(diǎn)的AA及GA對CHL細(xì)胞的DNA損傷情況；③CHL細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)：體外CHL細(xì)胞培養(yǎng)，分別加入0.1mM，1.0mM和5.0mM的AA及GA，在+S<,9>和-S<,9>狀態(tài)下，比較相同濃度下兩者引起CHL細(xì)胞的畸變率。 結(jié)果： 1、動物試驗(yàn)：①一般生長指標(biāo)：在試驗(yàn)過程中，不同性別各劑量組與對照組大鼠體重增長及臟器重量之間沒有顯著性差異。②細(xì)胞增殖：3個劑量組雄性大鼠的睪丸基底細(xì)胞及腎小管細(xì)胞LI

6、與對照組相比有顯著性增加；中、高劑量組雄性大鼠的結(jié)腸細(xì)胞LI與對照組相比有顯著性增加；3個劑量組雌性大鼠結(jié)腸及腎上腺細(xì)胞LI與對照組相比均有顯著性增加；高劑量組雌性大鼠甲狀腺及乳腺細(xì)胞LI與對照組相比有顯著性增加；③組織DNA損傷：肝、腎、腎上腺、肺、結(jié)腸、睪丸(雄)等組織的單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示，3個劑量組雌雄大鼠的彗星OLIVE尾矩與對照組相比均有顯著性增加。④組織中K-Ras蛋白的表達(dá)：Western blot檢測到3個劑量組雌雄

7、大鼠的結(jié)腸、腎上腺和睪丸(雄)組織中K-Ras的表達(dá)較對照組有顯著性增加，而其余組織(肺、肝、腎)中K-Ras的表達(dá)極低，且與正常組間無明顯差異。⑤病理指標(biāo)：對照組與3個劑量組雌雄大鼠的腦、甲狀腺、肺、腎、腎上腺、睪丸(雄性)、乳腺(雌性)均未見異常；中劑量組1例動物和高劑量組3例動物結(jié)腸出現(xiàn)糜爛、慢性潰瘍性改變，其余動物未見結(jié)腸病變；高劑量組6例動物肝臟Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增生活躍，部分肝細(xì)胞壞死，其余動物未見肝臟異常改變。

8、 2、體外試驗(yàn)：①CHL細(xì)胞DNA損傷：在第6、12、24小時時間點(diǎn)，經(jīng)各劑量組AA和GA處理的CHL細(xì)胞彗星尾矩較對照組均有顯著性增加；在各時間點(diǎn)，經(jīng)GA處理的CHL細(xì)胞與經(jīng)相同劑量AA處理的細(xì)胞相比，其彗星尾矩顯著增加；②CHL細(xì)胞染色體畸變：在±S<,9>存在的情況下，經(jīng)各劑量組從及GA處理的CHL細(xì)胞，其染色體畸變率均較陰性對照組有明顯增高，而經(jīng)GA處理的細(xì)胞染色體畸變率較相同劑量的AA組高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)

9、論： 1．動物試驗(yàn)：經(jīng)不同劑量AA灌胃處理6個月后，能引起F344大鼠肝、腎、腎上腺、肺、結(jié)腸、睪丸(雄)等組織明顯的DNA損傷；引起睪丸、甲狀腺、乳腺、結(jié)腸、腎上腺、腎等組織的細(xì)胞增殖，有劑量—反應(yīng)趨勢；Western blot結(jié)果顯示AA灌胃6個月后，能引起大鼠結(jié)腸、腎上腺和睪丸(雄)組織中K-Ras蛋白的表達(dá)較對照組增加，而對肺、肝、腎等組織無明顯作用。以上結(jié)果提示，AA可能引起組織細(xì)胞DNA損傷，從而激活靶基因ras，啟

10、動細(xì)胞增殖，并最終引起癌變的發(fā)生；實(shí)驗(yàn)動物的各主要臟器未見腫瘤的發(fā)生及癌前病變，但肝臟出現(xiàn)細(xì)胞增生活躍，提示肝臟可能是AA的靶器官。 2、體外試驗(yàn)：AA和GA均能引起體外培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的DNA損傷，有劑量—反應(yīng)關(guān)系及時間—反應(yīng)關(guān)系，且GA導(dǎo)致DNA損傷的能力強(qiáng)于AA；GA和從有致體外培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞突變的能力，說明AA的代謝物GA是其重要的遺傳毒性致癌機(jī)制之一；除此之外，AA本身也有遺傳損傷作用，提示AA有潛在的獨(dú)立于GA之外