Notch1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對食管鱗癌Eca109細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、背景與目的:食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率目前位于惡性腫瘤的第六位,而在中國則位于第四位,食管癌的病理類型主要是鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。在我國主要以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)為主,約占病例總數(shù)的90％以上。我國是食管癌發(fā)病率最高的國家之一,世界上70％的食管癌病例發(fā)生在我國。對于腫瘤的治療,目前所用的手段如手術(shù)切除、化學(xué)藥物療法、放射治療尚不完善,

2、還有待于在治療措施的基礎(chǔ)研究上有所突破。目前,針對食管癌的基因治療的途徑很多,其中基因矯正和誘導(dǎo)凋亡是重要的兩個方面,特別是細(xì)胞凋亡過程的研究已經(jīng)越來越受到重視。Notch蛋白是一個進(jìn)化上保守的跨膜受體家族,廣泛分布和表達(dá)在多個物種之中。研究發(fā)現(xiàn)Notch1作為一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,不僅對正常組織、細(xì)胞的分化、發(fā)育起重要作用,而且和一些腫瘤的發(fā)生和生長相關(guān),有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Notch1在許多實體瘤中異常表達(dá),如:如宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、肺癌、

3、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等。因此Notch1作為一種預(yù)防和治療腫瘤的新途徑越來越受到人們的重視。然而,Notch1與食管鱗癌的發(fā)生之間的關(guān)系,卻少有報道,尤其是對食管鱗癌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系尚不清楚?；诖?通過本實驗：
　　1、構(gòu)建Notch1真核表達(dá)載體;
　　2、觀察Notch1基因轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后對細(xì)胞凋亡的影響。旨在討論Notch1對食管鱗癌Eca109細(xì)胞凋亡的影響,為進(jìn)一步探討Notch1在食管鱗癌發(fā)生中的作用

4、提供理論依據(jù),并為進(jìn)一步研究Notch1基因治療食管癌的可行性打下實驗基礎(chǔ)。
　　方法:1.構(gòu)建Notch1基因的真核表達(dá)載體:將Notch1插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點之間,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Notch1。通過Trizol一步法從人胎盤組織中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,目的片斷連入T載體后經(jīng)PCR、雙酶切及序列鑒定等方法保證了插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+

5、)序列的正確性。并對重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Notch1進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定,證實構(gòu)建成功。
　　2.觀察Notch1基因轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后對細(xì)胞凋亡的影響。將Notch1基因體外轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞,通過倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀法收集轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h的細(xì)胞,檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:1.酶切分析和DNA測序表明:目標(biāo)序列準(zhǔn)確插入載體,pcDNA3.1(+)-No

6、tch1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　2.Notch1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞通過倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察:結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Notch1的24h、48h、72h后Eca109細(xì)胞在24小時細(xì)胞基本沒變化,從48h開始細(xì)胞逐漸開始凋亡,到72h可見細(xì)胞凋亡明顯增多,提示外源性Notch1片段的引入能引起Eca109細(xì)胞凋亡。
　　3.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Notch1載體的Eca109細(xì)胞通過Annexin V-F

7、ITC法檢測早期凋亡細(xì)胞在24h、48h、72h的凋亡率分別為20.57％、21.50％、38.03％;未轉(zhuǎn)染組在24h、48h、72h的凋亡率分別為4.40％、5.57％、8.80％;轉(zhuǎn)染空載體組在24h、48h、72h的凋亡率分別為3.88％、6.26％、8.55％。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Notch1載體的Eca109細(xì)胞組與未轉(zhuǎn)染的Eca109細(xì)胞組及轉(zhuǎn)染空載體組相比凋亡率明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。