重組BMP7腺病毒治療椎間盤退變的實驗研究.pdf

1、本實驗將原核表達載體pBlue-BMP7經一系列特定的限制性內切酶酶切，重組了BMP7的腺病毒載體(Ad-BMP7)，并轉染293細胞進行大量擴增、滴度測定。重組Ad-BMP7經限制性內切酶PI-SceI和I-CeuI雙酶切獲得BMP7基因片段，PCR擴增得到特異的擴增片段，表明重組的Ad-BMP7載體構建成功，其中攜帶有目的基因BMP7cDNA片段。 載體構建成功后，進行人退變髓核細胞的原代培養(yǎng)，并了解其生物學特性，用臺盼藍排

2、斥試驗進行細胞活力測定。發(fā)現人退變髓核細胞貼壁及生長的速度均十分緩慢，首次培養(yǎng)期間，髓核細胞活力可達100％，傳1代后細胞活力為80～90％。將腺病毒介導的綠色熒光蛋白基因(Ad-GFP)轉染至髓核細胞內，24小時后即有綠色熒光發(fā)出，持續(xù)時間可達4周。當MOI值為150時，轉染陽性率達100％，說明人退變髓核細胞可長期表達外源性基因。 報告基因轉染成功后，將Ad-BMP7轉染體外人髓核細胞，MOl值分別為20、50、100、15

3、0。RT-PCR擴增到特異性片斷，WesternBlot檢測細胞中BMP7在蛋白水平的表達。免疫組化檢測顯示實驗組呈強陽性染色而對照組呈弱陽性。ELISA檢測上清液中蛋白多糖和II型膠原的含量。發(fā)現二者的含量和病毒MOl值呈劑量依賴性，和對照組、空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義。說明人退變髓核細胞不僅能大量表達外源性的BMP7基因，還能在基因產物的作用下增加蛋白多糖和II型膠原合成。 體內研究中，取20只新西蘭大白兔，15只作為實驗

4、組，5只作為實驗對照組。實驗組椎間盤注射Ad-BMP7(6×106pfu)，實驗對照組注射Ad-GFP(6×10。pfu)，另設空白對照組。分別于注射后l周、2周和4周各處死5只實驗組兔子，注射后l周處死全部實驗對照組兔子。RT-PCR和免疫組織化學染色檢測BMP7的表達情況，免疫組織化學染色檢測II型膠原的表達情況。結果實驗組的髓核細胞顯示了BMP7染色陽性結果，1周、2周和4周組陽性染色率差異無顯著意義。實驗組的髓核組織間質II型膠

5、原呈陽性染色，1周、2周和4周的灰度值單因素方差分析：F=10．01，P=0．0028；兩兩比較結果：第1周與第2、第4周差別有統(tǒng)計學意義，第2、第4周間差別無統(tǒng)計學意義。說明Ad-BMP7轉染兔髓核細胞后，能獲得長期表達，并能促進II型膠原合成。 本實驗成功構建了重組BMP7腺病毒載體，進行了人退變椎間盤細胞的原代培養(yǎng)并獲得了成功。證明了BMP7基因可以在體內體外髓核細胞中得到持續(xù)的表達，并能促進蛋白多糖和II型膠原的合成。本