布魯氏菌二元調控系統(tǒng)TceSR和TcfSR的生物學功能研究.pdf

1、布魯氏菌病是由感染人和動物的布魯氏菌造成的對社會安全有嚴重危害的疾病，在世界上廣泛流行，尤其是在發(fā)展中國家，造成更為嚴重的經(jīng)濟損失。布魯氏菌是一類兼性胞內寄生菌，其毒力主要依賴于在宿主細胞內的生存和繁殖的能力。二元調控系統(tǒng)（two-component regulatory system，TCS）能夠對環(huán)境信號感受應答、傳遞以及處理的信號進行轉導、調節(jié)和控制。布魯氏菌有15對 TCS，已有研究表明，位于染色體 I的 TCS與布魯氏菌的毒力

2、密切相關，但位于染色體 II的 TCS的毒力表型及其調控機制還尚不清楚。本研究以布魯氏菌 TCS TceSR和 TcfSR為研究對象，通過探討 TCS TceSR和 TcfSR對布魯氏菌毒力表型、相關基因表達和胞內生存繁殖的影響，及其在小鼠體內的毒力和免疫保護力，為揭示布魯氏菌感染宿主細胞的分子機制提供線索，也為新疫苗的研發(fā)、相關疫病的預防、控制和抗病育種工作提供依據(jù)。
　　目的：本研究以羊種布魯氏菌參考株16M為研究對象，探討

3、TCS TceSR和 TcfSR的功能及其在布魯氏菌致病過程中的作用機制。（1）構建 TCS TceSR和 TcfSR啟動子失活的突變株，并對其進行鑒定。（2）分析 TCS TceSR和 TcfSR突變株相關毒力基因的胞內外轉錄水平，比較突變株和親本株毒力基因表達的差異，根據(jù)差異基因的功能及其在突變株中的轉錄變化，解釋突變株相關毒力表型的變化。（3）分析比較突變株和親本株胞內生存相關表型的差異，確定 TCS TceSR和 TcfSR對布

4、魯氏菌胞內存活的作用。（4）分析突變株在小鼠體內的毒力，探討 TCS TceSR和 TcfSR對布魯氏菌在小鼠體內建立慢性感染的作用。
　　方法：（1）利用同源重組和抗性替換的方法，構建了 TCS TceSR和 TcfSR啟動子失活的突變株；對獲得的基因突變株進行 PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性檢測。（2）布魯氏菌侵染巨噬細胞 RAW264.7，qRT-PCR檢測布魯氏菌相關毒力基因（主要包括脂多糖合成相關蛋白、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系統(tǒng)、轉

5、運系統(tǒng)、鞭毛系統(tǒng)、調控系統(tǒng)、壓力蛋白/泛素相關蛋白、氮源代謝分子）的胞內轉錄水平；親本株和突變株在體外刺激環(huán)境中培養(yǎng)30min。利用 qRT-PCR分析毒力基因 omp25、virB1、vjbR、gntR、dnaK、Hfq、htrA的轉錄變化。（3）比較突變株和親本株的胞內存活相關表型。布魯氏菌侵染小鼠巨噬細胞 RAW264.7，在侵染后不同時間，檢測細菌的黏附侵襲能力和胞內存活能力；親本株和突變株侵染巨噬細胞 RAW264.7，利用熒

6、光定量 PCR、流式細胞儀和共聚焦顯微鏡測定宿主細胞在細菌的侵襲下所引起的凋亡和自噬水平；構建能夠表達綠色熒光的布魯氏菌，侵染巨噬細胞 RAW264.7，觀察布魯氏菌與溶酶體的融合情況。（4）用布魯氏菌疫苗株和突變株分別腹腔接種免疫（106CFU）SPF級4-6周齡雌性 BALB/c小鼠；接種后的不同時間點采集免疫小鼠血清，采用間接 ELISA測定小鼠體內細胞因子 IFN-γ的水平和總的 IgG水平；無菌分離脾臟，測定脾臟載菌量，制備病

7、理切片，檢測突變株的毒力；用105CFU的16M進行攻毒實驗，檢測各菌株的保護力；克隆、表達、純化 TCES和 TCFS兩個蛋白，以純化的蛋白作為抗原，分別對突變株免疫小鼠的血清進行 Western Blot分析。
　　結果：（1）成功構建了 TCS TceSR和 TcfSR啟動子突變株16MΔTceSR和16MΔTcfSR，在15代內遺傳性穩(wěn)定；突變株和親本株的體外生長趨勢一致；體外刺激結果顯示，突變株對酸、堿、高鹽、熱應激、營

8、養(yǎng)缺陷和干燥的抵抗力降低。（2）親本株和突變株侵染細胞24h后，66個布魯氏菌相關毒力基因在胞內的轉錄水平發(fā)生了變化，其中在16MΔTceSR突變株中，41個（62.12％）基因高表達，25個（37.88%）基因低表達；在16MΔTcfSR突變株中，47個（71.21%）基因高表達，19（28.79%）個基因低表達；在體外刺激環(huán)境下，布魯氏菌胞內存活相關的基因在突變株中的轉錄水平均低于在親本株中的轉錄水平。（3）突變株對細胞的粘附能力和

9、胞內存活能力是減弱的；細胞凋亡研究發(fā)現(xiàn)，突變株與親本株引起宿主細胞凋亡程度相似；而細胞自噬結果卻發(fā)現(xiàn)，突變株引起細胞自噬水平低于親本株；溶酶體融合實驗顯示，侵染細胞24h時突變株組胞內的布氏小體與溶酶體融合率高于親本株組。（4）突變株免疫小鼠后，可誘導機體分泌 IFN-γ和 IgG，小鼠脾臟載菌量低于親本株，但仍存在一定的毒力；攻毒后，突變株免疫的小鼠對親本株可產(chǎn)生一定的免疫保護力；布魯氏菌重組蛋白 TCES和 TCFS可以作為診斷抗原