棉鈴蟲變態(tài)時(shí)期差異表達(dá)基因的鑒定及真核起始因子5C基因克隆及性質(zhì)研究.pdf

1、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)屬于鱗翅目夜蛾科(Lepidoptera Noctuidae)，在世界各地廣泛分布，危害棉花、谷物、玉米、土豆、大豆、高粱和煙葉等農(nóng)作物達(dá)上百種，往往造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是我國(guó)和世界農(nóng)業(yè)的主要害蟲之一。目前棉鈴蟲防治中使用的大多數(shù)化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人類健康有害，而對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物如Bt抗蟲棉的安全性也存在爭(zhēng)議。因此在理論研究的基礎(chǔ)上，發(fā)展新型生物農(nóng)藥一直是害蟲防治的研究熱點(diǎn)。完全變態(tài)類昆蟲要

2、經(jīng)過(guò)周期性幼蟲蛻皮和變態(tài)才能完成整個(gè)生活史，昆蟲發(fā)育的生理活動(dòng)是在一系列激素的精細(xì)調(diào)控下才得以順利完成。通過(guò)對(duì)棉鈴蟲蛻皮相關(guān)基因的研究，不僅可以為進(jìn)一步了解昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和蛻皮激素調(diào)控的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且在此基礎(chǔ)上可以發(fā)現(xiàn)新的分子靶標(biāo)，為害蟲防治提供新思路。本論文利用抑制性消減雜交(Suppression subtractivehybridization，SSH)的方法鑒定在棉鈴蟲變態(tài)時(shí)期差異表達(dá)的新基因，并從中選擇棉鈴蟲真核起始因

3、子5C(eukaryotic translation initiation factor 5C，eIF5C)作為研究對(duì)象，克隆了該基因的全長(zhǎng)，并對(duì)它的性質(zhì)進(jìn)行了研究。 蛻皮對(duì)于全變態(tài)昆蟲來(lái)說(shuō)，是一個(gè)重要的生理過(guò)程。全變態(tài)昆蟲的一生經(jīng)由一系列蛻皮活動(dòng)完成，其中包括幼蟲蛻皮，即各個(gè)齡期之間的蛻皮、化蛹蛻皮和羽化蛻皮，后兩者稱為變態(tài)蛻皮。幼蟲蛻皮包括不吃少動(dòng)的昏睡階段和脫皮階段兩個(gè)生理過(guò)程，而變態(tài)過(guò)程更為復(fù)雜，除與幼蟲蛻皮相似的蛻皮級(jí)

4、聯(lián)反應(yīng)外，還包括幼蟲組織解體和成蟲組織重建。蛻皮受蛻皮激素20-OH-蛻皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenile hormone，JH)共同調(diào)控。當(dāng)保幼激素存在時(shí)，蛻皮激素啟動(dòng)幼蟲不同齡期間的蛻皮，當(dāng)保幼激素滴度降低或消失時(shí)，蛻皮激素啟動(dòng)變態(tài)蛻皮。越來(lái)越多的證據(jù)證明有很多的激素和調(diào)節(jié)因子參與這個(gè)復(fù)雜的蛻皮信號(hào)途徑。目前已經(jīng)證明一些轉(zhuǎn)錄因子如EcR，USP，HR3，Broad C和細(xì)胞程序性死亡基因

5、參與該途徑，也鑒定了一些調(diào)控基因如Broad complex，E74B和E93，但對(duì)它們的下游基因還知之甚少，因此，蛻皮的分子機(jī)理仍然知之甚少。棉鈴蟲屬鱗翅目，與煙草天蛾(Manduca sexta)和家蠶(Bombyx mori)有共同的蛻皮特征，由于沒有基因組測(cè)序和商業(yè)芯片，蛻皮和變態(tài)差異表達(dá)基因的鑒定尤為困難。本室前期工作中已經(jīng)用雙向電泳的方法新鑒定了30個(gè)蛋白在蛻皮時(shí)期高表達(dá)，在此基礎(chǔ)上擬用抑制性消減雜交的方法鑒定更多蛻皮變態(tài)相

6、關(guān)的新基因。本文進(jìn)行了變態(tài)時(shí)期各個(gè)組織與取食時(shí)期各個(gè)組織的抑制性消減雜交鑒定變態(tài)時(shí)期差異表達(dá)的基因，并用取食時(shí)期各個(gè)組織與變態(tài)時(shí)期進(jìn)行抑制性消減雜交鑒定取食時(shí)期差異表達(dá)的基因。與本實(shí)驗(yàn)室柴連琴等完成的幼蟲蛻皮時(shí)期抑制性消減雜交SSH文庫(kù)共同分析，共得到100個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽expressed sequence tags(ESTs)，其中73個(gè)在基因庫(kù)中有相似序列，27個(gè)為未知基因。進(jìn)一步用RT-PCR的方法驗(yàn)證SSH的結(jié)果。有11個(gè)基因已

7、經(jīng)證明在蛻皮或變態(tài)時(shí)期表達(dá)水平有所變化，可能參與蛻皮變態(tài)過(guò)程。該研究提供了一系列鱗翅目昆蟲蛻皮或變態(tài)差異表達(dá)的新基因，如真核起始因子5(eIF5C)，核轉(zhuǎn)移因子等，它們可以作為進(jìn)一步研究鱗翅目昆蟲幼蟲蛻皮和變態(tài)調(diào)控機(jī)理的候選基因。該研究將拓展我們?cè)谌儜B(tài)昆蟲幼蟲蛻皮和變態(tài)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中的知識(shí)。 本論文選擇其中的eIF5C進(jìn)行了表達(dá)模式等性質(zhì)研究。真核翻譯起始階段需要很多蛋白質(zhì)因子的參與，大量證據(jù)證明，真核翻譯起始因子(eukar

8、yotic translation initiation factors，eIFs)不僅在蛋白質(zhì)翻譯的起始過(guò)程中有重要作用，還參與很多其它的生命活動(dòng)。一些eIFs已經(jīng)證明與信號(hào)途徑有關(guān)，如果蠅eIF4A通過(guò)介導(dǎo)SMAD(mother against dpp)降解負(fù)調(diào)控Dpp/BMP(decapentaplagic/bone morphogenetic protein)信號(hào)途徑，eIF6選擇性調(diào)控Wnt信號(hào)途徑。eIF5C蛋白包含一個(gè)N端

9、的亮氨酸拉鏈基序和一個(gè)C端的eIF5C結(jié)構(gòu)域。目前對(duì)eIF5C功能的研究很少，僅在果蠅中報(bào)道它與核糖體蛋白L5相互作用，可能參與蛋白合成。但含有eIF5C功能域或者亮氨酸拉鏈基序的其它同源基因功能報(bào)道較多，如果蠅中cryptocephal基因編碼亮氨酸拉鏈蛋白調(diào)控蛻皮和變態(tài)，具有GTP酶活化蛋白的功能，與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)等。由于同源基因具有相似的功能，我們推測(cè)在變態(tài)時(shí)期高表達(dá)的eIF5C可能在蛻皮變態(tài)過(guò)程中行使重要功能。 以SS

10、H文庫(kù)中獲得的EST為基礎(chǔ)，我們從棉鈴蟲中克隆到了eIF5C的全長(zhǎng)基因。cDNA全長(zhǎng)1675 bp，開放閱讀框1260 bp，編碼419個(gè)氨基酸(GenBank接收號(hào)EU526835)，命名為Ha-eIF5C在大腸桿菌中重組表達(dá)，并用Glutathione Sepharose 4B(GS4B)柱純化，用以免疫家兔制備多克隆抗體。 實(shí)時(shí)定量PCR (Quantitative real-time PCR，QRT-PCR)分析Ha-e

11、IF5C mRNA轉(zhuǎn)錄，結(jié)果顯示Ha-eIF5C在變態(tài)時(shí)期的頭胸部、表皮、中腸和脂肪體組織中都有高表達(dá)。QRT-PCR分析Ha-eIF5C在中腸和脂肪體各發(fā)育階段的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Ha-eIF5C在5齡頭殼爆裂時(shí)期有一個(gè)短暫的表達(dá)小高峰，然后在變態(tài)時(shí)期顯著上調(diào)。免疫印記結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)水平上，Ha-eIF5C在中腸和脂肪體各發(fā)育階段的表達(dá)情況和mRNA表達(dá)水平一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在中腸中，Ha-eIF5C定位于胞質(zhì)，較強(qiáng)的信號(hào)分布在