適應(yīng)重慶低海拔地區(qū)種植苦蕎品種的篩選及其查爾酮合成酶基因的克隆.pdf

1、苦蕎(Fagopyrum tataricum(Linn)Gaertn)是主要小宗雜糧之一和重要的富含黃酮的藥用作物。由于苦養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)豐富且富含黃酮類化合物，降血糖、降血脂功效顯著，更可用來預(yù)防和輔助治療糖尿病、高血脂和高血壓等疾病?，F(xiàn)代生物技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展為獲取高黃酮苦蕎新品種提供了可能，其前提是對(duì)其黃酮生物合成途徑的深入研究。 苦蕎在高海拔地區(qū)研究較多，而在低海拔地區(qū)的研究還是相對(duì)滯后的。針對(duì)這種狀況，在低海拔地區(qū)進(jìn)行苦蕎

2、的引種篩選、高產(chǎn)黃酮品種的選擇和苦蕎黃酮代謝工程等方面的研究，是一項(xiàng)非常有意義的重要研究課題。 本論文以來源于不同地區(qū)的17個(gè)苦蕎新品種為試驗(yàn)材料，在重慶248m的低海拔高度地區(qū)鑒定其主要經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)。結(jié)果表明：供試的17個(gè)苦蕎品種的生產(chǎn)力普遍較低，其中九江苦蕎，晉苦2號(hào)，西苦7—3等3個(gè)品種的籽粒產(chǎn)量較高；通過對(duì)其總黃酮含量的測(cè)定，晉苦2號(hào)的黃酮含量最高。 查爾酮合成酶(chalcone synthease，CHS，E

3、C 2.3.1.47)是一種聚酮合成酶，它催化黃酮類生物合成的第一個(gè)限速步驟。為研究CHS在苦蕎黃酮生物合成途徑中的作用以及為苦蕎代謝工程提供候選基因，本研究采用RACE技術(shù)從選育出的高產(chǎn)高黃酮含量的晉苦2號(hào)中克隆了CHS基因cDNA全長(zhǎng)(FtCHS，GenBank(R)登錄號(hào)：EU715255)，并對(duì)該基因及其所編碼的CHS蛋白進(jìn)行了詳盡的生物信息學(xué)分析。獲得結(jié)果如下：根據(jù)來源于蒺藜苜蓿、矮牽牛和掌葉大黃等植物的查爾酮合成酶基因的保守

4、序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得868bp的核心片段；BLAST分析表明該片段與其它植物CHS同源，初步確定為苦蕎CHS基因核心片段；根據(jù)該序列設(shè)計(jì)用于3’-RACE和5’-RACE的基因特異性引物，擴(kuò)增獲得517bp的3’-末端和359bp的5’-末端；將核心片段、3’-末端和5’-末端序列進(jìn)行拼接，獲得苦蕎CHS基因的cDNA電子全長(zhǎng)，進(jìn)而設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得其物理全長(zhǎng)，F(xiàn)tCHS 的全長(zhǎng)為1463bp。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，其編碼區(qū)長(zhǎng)度為1179

5、 bp，編碼長(zhǎng)度為393個(gè)氨基酸殘基的CHS蛋白，F(xiàn)tCHS分子量為43.156kDa，等電點(diǎn)為5.86；BLAST分析顯示FtCHS與掌葉大黃CHS序列相似性達(dá)到83％，表明成功克隆到苦蕎CHS；將FtCHS與細(xì)菌、真菌和植物CHSs構(gòu)建分子發(fā)育樹，F(xiàn)tCHS與掌葉大黃具有更近的進(jìn)化關(guān)系，并且與細(xì)菌、真菌等有共同的起源，這與BLAST結(jié)果相符；分析表明，對(duì)FtCHS進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，表明其中包含41.73％的α-螺旋、16.28％的片

6、層和41.98％的隨機(jī)卷曲：進(jìn)一步對(duì)FtCHS進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，表明其中由11個(gè)α-螺旋和15個(gè)β-片層組成，該蛋白能夠正常折疊形成典型的CHS蛋白三維結(jié)構(gòu)，三維結(jié)構(gòu)與Ms CHS2的三維結(jié)構(gòu)高度相似。本文的研究結(jié)果為分析生長(zhǎng)在低海拔地區(qū)苦養(yǎng)生產(chǎn)力低的原因提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)可用于在分子遺傳學(xué)水平探討CHS在苦蕎黃酮生物合成中的作用機(jī)理，并可進(jìn)一步用于遺傳轉(zhuǎn)化苦蕎，為實(shí)現(xiàn)苦養(yǎng)黃酮代謝工程，最終獲得轉(zhuǎn)基因修飾的高黃酮新材料或新品種奠定