浙江余杭中華鱉暴發(fā)性疾病主要病原及診斷技術(shù)研究.pdf

1、中華鱉養(yǎng)殖業(yè)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中經(jīng)濟(jì)效益較高的養(yǎng)殖種類。但隨著中華鱉養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，各種病害也日趨增多，暴發(fā)性傳染病更是引起人們的關(guān)注。
　　 2006年5-7月，杭州市余杭區(qū)某中華鱉養(yǎng)殖場生態(tài)鱉養(yǎng)殖池出現(xiàn)中華鱉急性發(fā)病并出現(xiàn)大量死亡，死亡中華鱉脖子腫大，底板發(fā)白，咽喉腮狀組織群毛突起、充血糜爛，胃腸粘膜嚴(yán)重充血，脾臟紫黑色，肝臟腫大呈花斑狀。作者對(duì)發(fā)病中華鱉進(jìn)行了細(xì)菌分離和病毒病原研究：從發(fā)病中華

2、鱉肝臟、脾臟、腎臟分離到氣單胞菌等細(xì)菌，對(duì)正常中華鱉進(jìn)行感染試驗(yàn)，以1×108cfu/ind攻毒不能使中華鱉發(fā)病；取典型癥狀的發(fā)病中華鱉內(nèi)臟勻漿上清除菌過濾后，以1：50-1：5000稀釋后以0.5mL/ind肌肉注射健康中華鱉，5d后陸續(xù)發(fā)病死亡，死亡中華鱉出現(xiàn)脖子腫大、咽喉及胃腸粘膜嚴(yán)重充血、脾臟紫黑色、肝臟腫大呈花斑狀等自然發(fā)病中華鱉相似癥狀；取人工感染發(fā)病中華鱉組織勻漿除菌后繼續(xù)感染健康中華鱉，已成功在健康中華鱉中重復(fù)感染5代，

3、均可復(fù)制出相同癥狀，人工感染發(fā)病鱉內(nèi)臟中未分離到細(xì)菌；取發(fā)病中華鱉組織經(jīng)2.5％戊二醛固定、磷鎢酸染色后超薄切片電鏡觀察，從腸組織中發(fā)現(xiàn)大量的球狀病毒，病毒顆粒大小為127±4nm。
　　 為進(jìn)一步研究病毒特性，作者以中華鱉腎組織、胚胎為材料，用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代腎細(xì)胞和胚胎細(xì)胞培養(yǎng)，采用15％胎牛血清及12％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別用于原代培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)，建立了中華鱉腎細(xì)胞株P(guān)sK-0612和胚胎細(xì)胞株P(guān)sE-06

4、12。目前兩個(gè)建株細(xì)胞分別傳代80余代及70余代，均為上皮樣細(xì)胞，生長和傳代穩(wěn)定；傳代細(xì)胞凍存后，復(fù)蘇狀態(tài)良好，最適培養(yǎng)溫度為28-30℃。對(duì)兩個(gè)建株細(xì)胞的生長指數(shù)、分裂指數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，繪制了生長曲線和分裂指數(shù)曲線，結(jié)果PsK-0612與PsE-0612的生長呈緩慢-快速-穩(wěn)定的趨勢(shì)；分裂指數(shù)分別于接種后第4天和第2天達(dá)到高峰；分別對(duì)50個(gè)第49代分裂中期PsK-0612細(xì)胞和第37代分裂中期PsE-0612細(xì)胞進(jìn)行分析表明，PsK-0

5、612與PsE-0612染色體數(shù)目為2n=66±2。
　　 將典型癥狀發(fā)病中華鱉組織勻漿濾液接種作者建立的中華鱉腎細(xì)胞株P(guān)sK-0612和胚胎細(xì)胞株P(guān)sE-0612；其中，接種后的PsK-0612在30℃培養(yǎng)4—6d后可出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞顆粒明顯增多、出現(xiàn)大量空洞，隨后大量脫落，對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)相同時(shí)間后未見明顯病變；用第4代出現(xiàn)病變細(xì)胞的懸液以0.5mL/ind注射健康中華鱉，對(duì)照為第4代出現(xiàn)病變細(xì)胞的懸液在56℃滅活30

6、min，6d后，中華鱉發(fā)病死亡，對(duì)照中華鱉未發(fā)??；PsE-0612未出現(xiàn)明顯的病變。病毒分類有關(guān)工作還在進(jìn)行中。
　　 從中華鱉中分離的嗜水氣單胞菌致病株T0608，該菌株毒力較強(qiáng)，是重要的繼發(fā)病原。取T0608福爾馬林滅活菌體注射免疫新西蘭兔，制備了高價(jià)免疫血清，血清的菌體凝集效價(jià)可達(dá)1/1280；用G蛋白親和層析純化兔IgG，將IgG用生物素標(biāo)記，建立了生物素—親和素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(BA-ELISA)；該法的最低檢

7、出限為2.5×103 cfu，相當(dāng)于0.5 ng菌體蛋白，其檢測(cè)靈敏度為ABC-ELISA(4.0×104cfu)和間接ELISA(4.0×104cfu)的16倍；本法對(duì)魚類氣單胞菌、擬態(tài)弧菌、海豚鏈球菌、大腸桿菌等無交叉反應(yīng)，有良好的特異性。用BA-ELISA法對(duì)湖州市龜鱉養(yǎng)殖場的水樣、中華鱉和巴西龜肝、腸道內(nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明本法可用于直接檢測(cè)發(fā)病中華鱉肝、腸中的嗜水氣單胞菌，可較好應(yīng)用于發(fā)病中華鱉的病原早期快速診斷及養(yǎng)殖中華鱉