廣州管圓線蟲(chóng)烯醇化酶基因的克隆、表達(dá)及各期組織定位分析.pdf

1、廣州管圓線蟲(chóng)(Angiostrongylus cantonensis)是一種嚴(yán)重的人畜共患自然疫源性寄生蟲(chóng)，其第三期幼蟲(chóng)(L3)可在福壽螺、魚(yú)、蝦等中間宿主中長(zhǎng)期寄生，人因?yàn)檎`食而感染，可引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎等病癥。廣州管圓線蟲(chóng)病嚴(yán)重危害了人們的健康，并且近來(lái)抗寄生蟲(chóng)藥物和抗生素的泛濫使寄生蟲(chóng)產(chǎn)生明顯的抗藥性，因此，從基因組學(xué)角度展開(kāi)對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)防治的研究成為必然的發(fā)展趨勢(shì)。寄生蟲(chóng)的能量代謝主要依靠糖酵解獲得能量，烯醇化酶是

2、糖酵解過(guò)程的至關(guān)重要的酶類，在生物的生命代謝活動(dòng)中起到不可忽視的作用。
　　 本論文以廣州管圓線蟲(chóng)為研究對(duì)象，以烯醇化酶基因作為研究的目的基因，對(duì)其克隆、表達(dá)、在各期蟲(chóng)體定位定量分析。首先在NCBI中找到廣州管圓線蟲(chóng)烯醇化酶基因部分序列，用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增5'和3'端部分，獲得基因全長(zhǎng)，利用NCBI，SignalP4.1等多種在線分析軟件預(yù)測(cè)烯醇化酶的結(jié)構(gòu)及進(jìn)行功能分析。根據(jù)基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物，并構(gòu)建表達(dá)載體，原核表達(dá)

3、并純化其重組蛋白后用以制備多克隆抗體。并以該抗體為一抗對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)做各期蟲(chóng)體的免疫組化研究。為測(cè)定烯醇酶在各期蟲(chóng)體中的差異表達(dá)，我們進(jìn)行了烯醇化酶在廣州管圓線蟲(chóng)L1、L2、L3、L4、L5和成蟲(chóng)雄蟲(chóng)、雌蟲(chóng)中實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
　　 在烯醇化酶基因全長(zhǎng)克隆后，已將序列上傳至GenBank，AcEno基因序列號(hào)為KC800926。廣州管圓線蟲(chóng)烯醇化酶基因全長(zhǎng)1667bp包含1350bp的編碼閱讀框(148-1452bp)，該基因

4、包括215 bp的3'UTR和147bp的5'UTR，編碼434個(gè)氨基酸，無(wú)信號(hào)肽序列，但具有一段明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域。
　　 廣州管圓線蟲(chóng)各期蟲(chóng)體中對(duì)烯醇化酶的免疫組化結(jié)果顯示烯醇化酶在一期到五期幼蟲(chóng)均勻分布于整個(gè)蟲(chóng)體，在雄蟲(chóng)體壁縱肌層、腸道、睪丸、儲(chǔ)精囊、輸精管，雌蟲(chóng)體壁縱肌層、腸道、子宮、卵巢均有大量的表達(dá)，主要是細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，可以看出烯醇化酶主要分布于高能量代謝區(qū)域。由于其在各個(gè)組織中均有分布，因此我們傾向于將其歸類為一種結(jié)構(gòu)