家蠶微孢子蟲烯醇化酶的表達(dá)特性分析及亞細(xì)胞定位.pdf

1、江蘇科技大學(xué)攻讀碩士學(xué)位研究生江蘇科技大學(xué)攻讀碩士學(xué)位研究生論文摘要論文摘要論文題目家蠶微孢子蟲烯醇化酶的表達(dá)特性分析及亞細(xì)胞定位研究方向微生物分子生物學(xué)學(xué)科、專業(yè)微生物學(xué)研究生姓名彭祥然導(dǎo)師姓名沈中元填表時(shí)間2017年06月01日學(xué)號(hào)：學(xué)號(hào)：142310006摘要：摘要：新陳代謝是生命體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，是物質(zhì)代謝和能量代謝的結(jié)合。微孢子蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生的真核生物，宿主域廣泛，寄生環(huán)境的復(fù)雜多樣使得不同種屬的微孢子蟲的代謝情況存在很大的差

2、異。對(duì)微孢子蟲的基因組分析發(fā)現(xiàn)其基因組中編碼蛋白的序列在長(zhǎng)度和數(shù)量上都有著很大程度的縮減，尤其是與代謝相關(guān)的基因，因此微孢子蟲的代謝研究一直是學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。對(duì)家蠶微孢子蟲的基因組分析發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲擁有完整的糖酵解途徑，能夠通過(guò)該途徑獲取生命活動(dòng)所需的部分能量。烯醇化酶（Enolase，ENO）是糖酵解過(guò)程中的限速酶，對(duì)烯醇化酶的研究能夠?yàn)槲覀兏玫亓私馕㈡咦酉x的能量代謝提供一定的基礎(chǔ)。且近年來(lái)也有烯醇化酶新的功能的發(fā)現(xiàn)報(bào)道，因此烯醇

3、化酶在家蠶微孢子蟲的生命活動(dòng)中是否參與到其他的過(guò)程當(dāng)中也是我們關(guān)注的問(wèn)題。本研究依據(jù)微孢子蟲數(shù)據(jù)庫(kù)中家蠶微孢子蟲烯醇化酶的編碼序列設(shè)計(jì)引物，以家蠶微孢子蟲DNA為模板PCR擴(kuò)增獲得家蠶微孢子蟲烯醇化酶基因NbENO。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示該基因F全長(zhǎng)1239bp，編碼413個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量46.323kD，等電點(diǎn)6.13；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（28.33%）、延伸片段（22.52%）和無(wú)規(guī)則卷曲（49.15%）組成；含

4、有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)糖基化位點(diǎn)；無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域存在，不具備典型的分泌蛋白和跨膜蛋白的特征。通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他12種微孢子蟲的烯醇化酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示NbENO與蜜蜂微孢子蟲烯醇化酶基因序列（NcENO）的親緣關(guān)系較近，序列比對(duì)顯示二者的編碼基因一致性為62.10%。將NbENO基因插入原核表達(dá)載體pET28a，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28aNbENO，在目的蛋白N端引入6His標(biāo)簽；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosatta（DE3）感

5、受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組蛋白NbENO的原核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDSPAGE檢測(cè)和WesternBlot的檢測(cè)結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白約50kD大小，結(jié)果與預(yù)測(cè)相符，證明成功地獲得了原核表達(dá)的重組蛋白NbENO。通過(guò)鎳親和柱純化獲得重組蛋白NbENO，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，通過(guò)ProteinA親和純化抗體antiNbENOAb。經(jīng)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)為1:512000，WesternBlot驗(yàn)證顯示antiNbENO