廣州管圓線蟲GAPDH基因的克隆表達及免疫診斷價值初步研究.pdf

1、廣州管圓線蟲[Angiostrongylus cantonesis(Chen,1935)Doughert，1946]<'[1,2]>寄生于人體時引起嗜酸性粒細胞增多性腦膜腦炎或腦膜炎(Eosinophilic meningitis ormeningoencephalitis,EM)<'[3]>，是一種人獸共患食源性寄生蟲病。廣州管圓線蟲對人體的侵害主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病情嚴重危害較大，如不及時治療可引起嚴重后果甚至死亡。然而近年來廣州

2、管圓線蟲病的流行已經(jīng)由太平洋沿岸地區(qū)而波及美國、歐洲、澳大利亞等地區(qū)<'[4]>，我國的福建、臺灣以及其它地區(qū)曾發(fā)生了多次暴發(fā)流行<'[5-10]>。因此廣州管圓線蟲病也引起了我國的廣泛的重視，2003年衛(wèi)生部將其列為新發(fā)傳染病<'[11]>。廣州管圓線蟲寄生于多種鼠類的肺動脈內(nèi)，一期幼蟲隨宿主糞便一起排出體外，當被吞入或主動侵入中間宿主(螺類和蛞蝓等)體內(nèi)后，在組織中發(fā)育為第二及第三期幼蟲，人因生食或半生食含本蟲幼蟲的中間宿主或轉(zhuǎn)續(xù)宿

3、主而感染<'1,12]>。廣州管圓線蟲的能量代謝與其他寄生蟲相似，獲取能量的重要方法就是無氧代謝，而3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)則是糖酵解過程中的一個重要酶，參與細胞的基本代謝。其催化3-磷酸甘油醛的醛基羧化而成為1，3-二磷酸甘油酸，在這一反應過程中產(chǎn)生一個ATP。GAPDH還是一個多功能酶，它還在細胞發(fā)育、神經(jīng)細胞的凋亡和DNA的修復等過程中發(fā)揮重

4、要作用<'[13]>。此外，寄生蟲的3-磷酸甘油醛脫氫酶具有一定的免疫原性<'[14-17]>。本研究利用分子生物學的方法對廣州管圓線蟲的GAPDH基因進行生物信息學分析后克隆、構(gòu)建原核表達載體pET-30a-(+)-GAPDH、大量表達后獲得具有生物學活性的3-磷酸甘油醛脫氫酶目的蛋白，分析其免疫學活性，能否被感染的動物血清和病人血清特異性識別，并為廣州管圓線蟲病免疫學診斷的進一步研究奠定基礎。研究目的本研究利用基因克隆和重組表達的方

5、法構(gòu)建廣州管圓線蟲3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的體外表達系統(tǒng)，獲得大量的3-磷酸甘油醛脫氫酶重組蛋白，用免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附反應的方法進一步分析免疫學活性，即目的蛋白作為抗原能否與廣州管圓線蟲病人的血清和感染動物血清特異性結(jié)合，以期為廣州管圓線蟲病的實驗室診斷研究提供參考。 研究方法利用生物信息學方法對廣州管圓線蟲GAPDH基因序列進行分析，找出其開放讀碼框，PCR方法體外擴增該基因進行T-A克隆并進而構(gòu)建原核表達載體pE﹪30a

6、(+)-GAPDH，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，對融合蛋白進行表達。反復優(yōu)化并得到最佳表達條件后，在原核表達系統(tǒng)中進行大量表達重組蛋白，制備細胞抽提物，經(jīng)Ni-NTAHis·Brad Resin親和層析柱進行蛋白質(zhì)純化，SDS-PAGE方法進行鑒定，免疫印跡和酶鏈免疫反應的方法分析其與廣州管圓線蟲病人血清和感染動物血清結(jié)合的敏感性和特異性。 研究結(jié)果獲得了廣州管圓線蟲GAPDH基因完整的開放讀碼框，利用生物信息學的方法對該基因及其表

7、達的蛋白質(zhì)進行了分析。成功克隆并擴增目的基因，經(jīng)過T-A克隆獲得了高拷貝量的GAPDH目的基因，所構(gòu)建的融合表達載體pE﹪30a-(+)-GAPDH成功轉(zhuǎn)染入大腸桿菌BL21，經(jīng)過反復優(yōu)化表達條件該表達系統(tǒng)能夠在28-30℃、IVTG終濃度0.7-0.8mmol/L誘導7h的條件下大量、穩(wěn)定地表達目的蛋白，以非可溶性表達為主，在變性條件下純化該目的蛋白后進行蛋白質(zhì)復性，SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白質(zhì)純化效率較好，成分純凈單一。以融合蛋白

8、作為抗原，用免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附反應的方法觀察其與廣州管圓線蟲病人血清和感染動物血清結(jié)合的敏感性和特異性，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)有一定的免疫學活性，但與其它寄生蟲病人或動物血清存有一定的交叉反應性。 結(jié)論獲得了廣州管圓線蟲3．磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)的序列，初步對該基因進行了生物信息學分析，成功構(gòu)建了該基因的原核表達體系。該目的蛋白能夠與廣州管圓線蟲病人血清和感染動物的血清有結(jié)合反應，但與其它寄生蟲病人或動物血清存有一定的