犬血清IgG的純化及其部分特性研究.pdf

1、隨著養(yǎng)犬業(yè)的迅速發(fā)展,對犬病的診斷和控制尤顯重要。犬血清中IgG水平的測定,已是臨床免疫檢驗(yàn)和體液免疫研究的常用指標(biāo)。作為研究工具,制備針對免疫球蛋白的多克隆或單克隆抗體己成為免疫學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。制備多克隆或單克隆抗體的關(guān)鍵就是分離純化出盡可能多的純度較高的免疫球蛋白,為此本文對犬血清IgG的純化進(jìn)行了探討,并制備了多克隆抗體,對IgG部分特性進(jìn)行了初步分析。 ⑴采用飽和硫酸銨鹽析、SephadexG-200柱層析法從犬血清中

2、獲得IgG,經(jīng)PAGE電泳、SDS-PAGE電泳和免疫電泳鑒定,純化后的IgG達(dá)到了電泳純。Folin-酚法測IgG濃度,繪制了純化過程的洗脫曲線。純化的犬血清IgG用于制備鼠抗犬血清IgG多克隆抗體。采用免疫雙擴(kuò)散法、間接ELISA法和Western Blot對鼠抗犬血清IgG多克隆抗體進(jìn)行了鑒定,免疫雙擴(kuò)散法和間接。ELISA法測得多抗的效價分別為1:16和1:128000,Western Blot顯示出多抗與IgG的重鏈和輕鏈反應(yīng)

3、的兩條特異性條帶。 ⑵建立了以純化犬血清IgG為包被抗原的間接ELISA法,優(yōu)化后得出以下最佳反應(yīng)條件：抗原包被量為0.25ug/mL,陽性和陰性對照血清稀釋度為1: 2000,酶標(biāo)抗體羊抗鼠IgG-HRP的稀釋度為1: 5000,底物最適作用時間在20min左右。 ⑶對犬血清IgG的部分特性進(jìn)行了分析：①凝膠電泳分析變性還原條件下電泳(SDS-PAGE)結(jié)果表明,犬IgG重鏈和輕鏈分子量分別為58KD和27KD;變性非

4、還原條件下電泳只有一條主要條帶,分子量為170KD,與SDS-PAGE所測結(jié)果一致。②木瓜蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌杆釯gG得到29kD和27kD兩個片斷,Western Blot分析其有很高的生物活性。③Western Blot分析以鼠抗犬血清IgG多克隆抗體作為免疫印跡的探針,分析純化犬IgG免疫原性和反應(yīng)原性。Western Blot分辨力明顯高于凝膠電泳,但雜條帶明顯增多,鼠抗血清可識別IgG、IgG重鏈和輕鏈,說明純化IgG有