雞血清IgG的純化及其單抗制備與鑒定.pdf

1、IgG是血清中主要的免疫球蛋白(Ig)，占血清Ig總量的75％～80％，它是血液中主要的抗體成分，血清中IgG水平的測(cè)定，已是疫苗免疫效果評(píng)定和體液免疫研究的常用指標(biāo)。與常規(guī)免疫血清相比，單克隆抗體具有與抗原結(jié)合的高特異性，是免疫學(xué)和血清學(xué)研究的重要工具，在畜牧獸醫(yī)的疾病診斷與治療方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。在養(yǎng)禽業(yè)中，運(yùn)用這些單克隆抗體來(lái)檢測(cè)疫病特異性的抗體，對(duì)全面、系統(tǒng)地了解禽的機(jī)體對(duì)病原體感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)并采取相應(yīng)的防制措施有重要意義。

2、此外，為研制有效試劑盒，檢測(cè)禽病及疫苗免疫水平奠定基礎(chǔ)。
　　 本文主要圍繞雞免疫球蛋白的提純及其單抗制備與鑒定，做了如下工作：
　　 首先，采用飽和硫酸銨鹽析粗提雞血清Ig，然后再用葡聚糖G200凝膠層析分離純化IgG。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定，表明純化后的IgG達(dá)到了一定純度。同時(shí)，用Folin-酚法進(jìn)行濃度測(cè)定，IgG蛋白濃度達(dá)到2.4mg/mL。
　　 其次，用純化后的雞IgG按常規(guī)方法免疫

3、6～8周Balb/c雌性小鼠，無(wú)菌取三次免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，采用間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，連續(xù)進(jìn)行兩次亞克隆，共獲得了四株分泌抗雞IgG單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為C44、C45、C67、C68。經(jīng)過(guò)五次亞克隆，四株單克隆雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定分泌抗IgG抗體。
　　 最后，對(duì)這四株單克隆抗體從效價(jià)、Ig亞類(lèi)、特異性以及反應(yīng)交叉性這些免疫特性方面進(jìn)行鑒定，通過(guò)間接ELISA試驗(yàn)測(cè)定

4、，C44、C45、C67、C68四株單克隆雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水抗體滴度分別為1：400、1：1600、1：3200、1：400和1:640000、1:320000、1：640000、1：80000;小鼠單抗Ig類(lèi)/亞類(lèi)鑒定用酶標(biāo)二抗即用試劑盒來(lái)測(cè)定得出四株單克隆抗體的重鏈均為IgG1型；運(yùn)用Western Blot方法分析四株單克隆抗體的特異性，表明：C44株、C45株單抗是抗雞IgG輕鏈，C67株、C68株單抗與雞血清中

5、IgG重鏈發(fā)生特異性結(jié)合，為抗雞IgG重鏈的單抗；以間接ELISA測(cè)定四株單克隆抗體與豬、兔和鴨等動(dòng)物血清的交叉反應(yīng)性，結(jié)果顯示單克隆抗體C44、C45、C67、C68僅特異識(shí)別雞IgG，未見(jiàn)與其他動(dòng)物血清發(fā)生交叉反應(yīng)，并進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，表明C44株、C45株單抗與雞血清中IgG的輕鏈發(fā)生特異性反應(yīng)，與鴨、兔、豬血清均沒(méi)有發(fā)生特異性反應(yīng)，C67株、C68株單抗均抗雞血清中IgG重鏈，與鴨、兔、豬血清均不發(fā)生特異性結(jié)合。