雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白的表達(dá)、純化及其單克隆抗體的制備與特性鑒定.pdf

1、白細(xì)胞介素18能明顯誘導(dǎo)Th1和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，還可誘導(dǎo)IL-2、GM-CSF及TNF-α等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。IL-18不但具有抗病毒、抗腫瘤活性，也可作為加強(qiáng)和改善機(jī)體免疫應(yīng)答的免疫佐劑，與病毒的保護(hù)性抗原基因共表達(dá)可加強(qiáng)和改善機(jī)體的免疫應(yīng)答。在某些疾病中監(jiān)測IL-18的水平可以動(dòng)態(tài)觀察和了解疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸以及機(jī)體的免疫反應(yīng)規(guī)律，所以有必要利用抗IL-18單克隆抗體建立相應(yīng)的檢測方法。到目前為止，國內(nèi)外已有人、小鼠、猴、豬

2、、牛和羊等種屬的IL-18商品化制劑及其相應(yīng)的單克隆抗體(McAb)或多克隆抗體(PcAb)以及夾心ELISA試劑盒的商品化供應(yīng)。但目前，國內(nèi)尚未見雞IL-18單抗制備方面的報(bào)道。
　　 本課題對(duì)雞IL-18(ChIL-18)成熟蛋白的單克隆抗體進(jìn)行了研究。將雞IL-18的成熟蛋白基因經(jīng)擴(kuò)增后亞克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定后，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-mChIL18。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入高效

3、表達(dá)菌Rosetta(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞中，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到大小為23KDa的融合蛋白，并利用載體上所帶有的His標(biāo)簽蛋白這一特點(diǎn)，采用Ni-NTA親和層析法純化重組蛋白ChIL-18，從而獲得了純度較高的蛋白，其含量最高可達(dá)7.8mg/mL，最低為1mg/mL。
　　 利用純化的重組ChIL-18蛋白對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，并建立了檢測小鼠抗體水平和單抗鑒定的間接ELISA檢測方法。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定了間接ELISA

4、測定小鼠抗體水平以及篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株的最佳反應(yīng)條件，最佳抗原包被質(zhì)量濃度為4μg/mL，陰陽性血清稀釋倍數(shù)為1:104，羊抗鼠IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物最佳稀釋倍數(shù)為1:4000,抗原抗體最佳結(jié)合時(shí)間是1.5h，血清與二抗最適反應(yīng)時(shí)間是1h。融合前抗體效價(jià)達(dá)到1:106，滿足融合時(shí)對(duì)小鼠抗體的要求。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與加強(qiáng)免疫后的小鼠脾細(xì)胞在PEG作用下進(jìn)行融合，經(jīng)間接ELISA方法檢測融合細(xì)胞，經(jīng)過3次亞克隆篩選出能穩(wěn)定分泌抗體

5、的雜交瘤細(xì)胞株，最終確定兩株單抗2E6和1G9作為試驗(yàn)研究對(duì)象，并大量制備了單抗腹水。
　　 兩株單抗亞型鑒定表明，均屬于IgM亞型。1G9和2E6的腹水效價(jià)分別為1:5.12×105和1:3.2×104。ELISA疊加試驗(yàn)分析表明，1G9和2E6可分別結(jié)合到IL-18不同的抗原位點(diǎn)上，兩者具有疊加性。Westernblot鑒定結(jié)果表明，單抗2E6和1G9只能與重組ChIL-18蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，不能與相同原核表達(dá)質(zhì)粒及相同表