鵝白細胞介素-2成熟蛋白基因表達及其免疫佐劑效應(yīng)的研究.pdf

1、根據(jù)本實驗室在GenBank中注冊的四川白鵝白細胞介素2(GoIL-2)基因序列，用OLIGO6.0設(shè)計PCR引物，對GoIL-2基因進行PCR擴增、序列測定及生物信息學(xué)分析后，開展GoIL-2基因原核表達載體構(gòu)建和表達產(chǎn)物純化、表達產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測、表達產(chǎn)物對小鵝瘟弱毒疫苗和VP3基因工程重組亞單位疫苗的佐劑效應(yīng)研究，獲如下結(jié)果： 1.GoIL-2原核表達、產(chǎn)物純化和生物學(xué)活性 PCR擴增GoIL-2成熟蛋白基因并克

2、隆到pMD18-T載體，測序鑒定后將其連接到原核表達載體pET32a+，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達。結(jié)果，表達出大小約34KD重組GoIL-2蛋白，以可溶性形式存在，占菌體總蛋白的42.5％。重組蛋白經(jīng)鎳金屬螯合介質(zhì)填料(Ni+-MIAC)后得到純化，復(fù)性后用MTT法檢測表達產(chǎn)物的相對生物學(xué)活性單位為110672U/mg。 2.重組GoIL-2對小鵝瘟VP3基因工程重組亞單位疫苗、GPV弱毒疫苗免疫青年鵝佐

3、劑效應(yīng)研究 重組GoIL-2以500U/只、1000U/只、2000U/只分別與小鵝瘟VP3基因16抗原決定簇重組亞單位工程疫苗(Ag16v)、小鵝瘟VP3基因10抗原決定簇重組亞單位工程疫苗(Ag10v)和GPV弱毒疫苗同時免疫青年鵝，分為12組：500U+Ag16v、1000U+Ag16v、2000U+Ag16v、500U+Ag10v、1000U+Ag10v、2000U+Ag10v、1000U+GPV，同時設(shè)Ag16v對照組

4、、Ag10v對照組、GPV弱毒對照組、IL-2對照組、PBS對照組。 (1)細胞免疫：免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d、49d采血，用MTT法檢測青年鵝細胞免疫水平。結(jié)果：試驗組鵝外周血中T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率于7-49d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于PBS對照組。①2000U+Ag16v組，14-49d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于Ag16v對照組和500U+Ag16v組，于21

5、-28d顯著(P＜0.05)高于1000U+Ag16v組。500U+Ag16v組與Ag16v對照組差異不顯著(P＞0.05)。②2000U+Ag10v組，14-49d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于Ag10v對照組和500U+Ag10v組，于21-28d顯著(P＜0.05)高于1000U+Ag10v組。500U+Ag10v組與Ag10v對照組差異不顯著(P＞0.05)。③1000U+GPV組，14-28d極顯著(P＜0.

6、01)或顯著(P＜0.05)高于GPV對照組。結(jié)果表明GoIL-2能夠增強小鵝瘟VP3基因工程重組亞單位疫苗和GPV弱毒疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答，且具有一定的劑量依賴性。 (2)體液免疫：免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d、175d采血，用ELISA法和中和抗體試驗檢測青年鵝體液免疫水平。結(jié)果：①ELISA抗體：試驗組于7-175d極

7、顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于PBS對照組、IL-2對照組。2000U+Ag16v組于14-147d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于Ag16v對照組和500U+Ag16v組，于21-28d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于1000U+Ag16v組。500U+Ag16v組與Ag16v對照組差異不顯著(P＞0.05)。2000U+Ag10v組于14-147d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.

8、05)高于Ag10v對照組、500U+Ag10v組，于21d、49d、77d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于1000U+Ag10v組。500U+Ag10v組與Ag10v對照組差異不顯著(P＞0.05)。1000U+GPV組，于21d時達到峰值，于14-147d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于GPV弱毒疫苗對照組。②中和抗體：試驗組、對照組(除PBS對照組、IL-2對照組)都產(chǎn)生了特異性GPV抗體。2000

9、U+Ag16v組21-147d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于500U+Ag16v組和Ag16v對照組，21-35d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于1000U+Ag16v組。500U+Ag16v組與Ag16v對照組差異不顯著(P＞0.05)。2000U+Ag10v組于14-147d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于Ag10v對照組和500U+Ag10v組，于21d、28d極顯著(P＜0.01

10、)高于1000U+Ag10v組。500U+Ag10v免疫組中和抗體效價與Ag10v對照組差異不顯著(P＞0.05)。1000U+GPV組21-147d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于GPV弱毒疫苗對照組。體液免疫試驗表明重組GoIL-2能夠增強小鵝瘟VP3基因工程重組亞單位疫苗和GPV弱毒疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，且具有一定的劑量依賴性。 3.重組GoIL-2對小鵝瘟VP3基因工程重組亞單位疫苗、GPV弱毒疫苗免疫

11、開產(chǎn)前種鵝佐劑效應(yīng)研究 重組GoIL-2以6000U分別與GPV弱毒疫苗、Ag16v和Ag10v免疫種鵝，同時設(shè)Ag16v對照組、Ag10v對照組、GPV弱毒對照組、IL-2對照組、PBS對照組，免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d、175d各組隨機采集種鵝血、收集種蛋進行血清和卵黃抗體檢測，同時孵化種蛋以100個LD50GPV-CH

12、v強毒株對后代雛鵝進行攻毒保護試驗。結(jié)果：(1)血清ELISA抗體：試驗組于7-175d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于PBS對照組、IL-2對照組。6000U+Ag16v、6000U+Ag10v和6000U+GPV免疫組，7-147d分別極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于Ag16v、Ag10v和GPV對照組。(2)血清中和抗體：試驗組、對照組(除PBS對照組、IL-2對照組)都產(chǎn)生了特異性GPV抗體。60

13、00U+Ag16v、6000U+GPV免疫組，21-147d分別極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于Ag16v、GPV對照組。6000U+Ag10v，14-147d極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于Ag10v對照組。(3)卵黃ELISA抗體：6000U+Ag16v、6000U+Ag10v和6000U+GPV免疫組，7-147d分別極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于Ag16v、Ag10v和GPV對照

14、組。(4)卵黃中和抗體：試驗組和對照組(除PBS對照組、IL-2對照組)都產(chǎn)生了特異性GPV抗體。其中IL-2+Ag16v、IL-2+Ag10和IL-2+GPV免疫組抗體的中和效價于21-147d分別極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于Ag16v、Ag10v和GPV對照組。表明重組GoIL-2增強了小鵝瘟VP3基因工程重組亞單位疫苗和GPV弱毒疫苗誘導(dǎo)的種鵝血清和卵黃抗體水平。(5)攻毒保護率：Ag16v+IL-2、Ag10

15、v+IL-2、GPV+IL-2于21d達到100％保護率持續(xù)至161d，175d時對后代雛鵝的保護率分別降到80％、80％、90％，對后代雛鵝的免疫保護期達140d，而Ag16v、Ag10v、GPV對照組于28d達到100％保護率分別持續(xù)至147d、147、161d，對后代雛鵝的免疫保護期分別為119d、119、133d。試驗組其后代雛鵝免疫保護期較對照組長7-21d，表明重組GoIL-2能夠提高小鵝瘟VP3基因工程重組亞單位疫苗和GP