禁食和球蟲感染對(duì)不同TI肉雞生長和膽固醇代謝的影響.pdf

1、緊張性不動(dòng)(Tonic immobility，TI)是動(dòng)物面對(duì)外界刺激時(shí)因恐懼而表現(xiàn)出全身不動(dòng)的一種反應(yīng)。根據(jù)TI持續(xù)時(shí)間的長短可將肉雞分為長TI(LTI)和短TI(STI)兩種表型。我們以往的研究結(jié)果表明，STI表型肉雞生長性能優(yōu)于LTI肉雞，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)不同TI表型肉雞進(jìn)行限飼或病原感染應(yīng)激處理，研究不同TI表型肉雞對(duì)不同應(yīng)激刺激的反應(yīng)性差異，并深入研究球蟲感染對(duì)內(nèi)雞小腸上皮細(xì)胞增殖和膽固醇代謝的影

2、響及生理機(jī)制。
　　1.禁食對(duì)肉雞下丘腦攝食和能量代謝相關(guān)因子表達(dá)的影響
　　根據(jù)TI持續(xù)時(shí)間長短分別于11d，18d和26 d進(jìn)行TI誘導(dǎo)，三次誘導(dǎo)結(jié)果一致的肉雞分為短TI組(STI)和長TI組(LTI),三次記錄不一致者則淘汰。按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)至42日齡時(shí)進(jìn)行16h禁食處理分為STI對(duì)照組(STI-control)，STI禁食組(STI-fasting)，LTI對(duì)照組(LTI-control)和LTI禁食組(LTI-fasti

3、ng)。采用生化分析和real-time PCR技術(shù)檢測肉雞血液中相關(guān)理化指標(biāo)、下丘腦食欲和能量調(diào)節(jié)相關(guān)因子的基因表達(dá)。結(jié)果顯示，與自由采食肉雞比較，16h禁食導(dǎo)致肉雞血清中總膽固醇(Tch)、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(la

4、ctic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)含量顯著升高(P＜0.05);而血液葡萄糖(glucose，Glu)、甘油三酯(triglyceride，TG)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，

5、TAOC)顯著下降(P＜0.05)。TI顯著影響血清中低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)水平，且LTI表型肉雞高于STI。與LTI肉雞相比，STI肉雞下丘腦神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)基因表達(dá)有上升的趨勢（P=0.095），而其他食欲調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)水平無顯著差異。禁

6、食引起下丘腦膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP1)基因和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS) mRNA表達(dá)、磷酸化糖皮質(zhì)激素受體(phosphorylation glucocorticoid receptor，p-GR)和磷酸化AMP激活蛋白酶(phosphorylation AMP-activated protein k

7、inase，p-AMPK)蛋白含量顯著下降(P＜0.05)，但肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl-transferase1，CPT1)基因表達(dá)顯著上升(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，禁食16h導(dǎo)致肉雞機(jī)體能量負(fù)平衡狀態(tài)，下丘腦攝食和能量代謝相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)變化，但不同TI表型肉雞對(duì)禁食的反應(yīng)性無明顯差異，而STI肉雞早期生長較快可能與其下丘腦NPY基因表達(dá)較高有關(guān)。
　　2.球蟲感染對(duì)肉雞生長性

8、能、小腸上皮細(xì)胞增殖和膽固醇代謝的影響
　　根據(jù)TI持續(xù)時(shí)間將肉雞分為LTI和STI兩種表型，在32日齡時(shí)對(duì)內(nèi)雞進(jìn)行球蟲感染處理，7天后采樣分析，肉雞分為STI對(duì)照組(STI-control)、STI球蟲組(STI-coccidium)、LTI對(duì)照組(LTI-control)和LTI球蟲組(LTI-coccidium)。對(duì)表觀指標(biāo)的分析結(jié)果顯示，球蟲感染時(shí)不同TI表型肉雞的生產(chǎn)性能、腸道損傷程度和血液生化指標(biāo)均無顯著差異，提示不同

9、TI表型肉雞應(yīng)對(duì)急性感染應(yīng)激時(shí)反應(yīng)無顯著差異。然而，球蟲感染顯著影響肉雞腸道的組織形態(tài)、上皮增殖和膽固醇代謝。本章實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究球蟲感染對(duì)腸道黏膜細(xì)胞增殖及膽固醇代謝的影響及生理機(jī)制。
　　結(jié)果表明，球蟲感染組肉雞的每克糞便中球蟲卵囊數(shù)含量很高（P＜0.01），而在對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊。HE和電鏡結(jié)果顯示，球蟲感染破壞小腸結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞病理性損傷。與對(duì)照組相比，球蟲感染組肉雞的十二指腸病變損傷嚴(yán)重(P＜0.01)，采食

10、量有上升趨勢(P=0.06)，但體重?zé)o明顯差異。球蟲感染顯著升高肉雞血液中GSH-PX酶活性和尿素(UA)(P＜0.01)濃度，提示氧化應(yīng)激的上升;顯著降低循環(huán)血液中總膽固醇(Tch)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平(P＜0.01);甘油三酯(TG)含量有下降的趨勢（0.05＜P＜0.1）。此外，球蟲感染導(dǎo)致血液中皮質(zhì)酮升高(P＜0.01)。
　　小腸炎癥時(shí)，上皮細(xì)胞增殖能力加強(qiáng)以替代損傷的腸上皮細(xì)胞。膽固醇不僅是合成應(yīng)激

11、激素一糖皮質(zhì)激素的前體物，亦是細(xì)胞膜的重要組分，是細(xì)胞增殖和生長發(fā)育的必需元件。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，球蟲感染導(dǎo)致小腸結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷，腸上皮細(xì)胞增殖能力顯著提高并激活參與先天性免疫反應(yīng)基因的表達(dá)。球蟲感染導(dǎo)致血液中總膽固醇水平極顯著下降（P＜0.01），而十二指腸組織中膽固醇含量顯著升高(P＜0.05)。球蟲感染并未影響十二指腸膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)。然而，球蟲感染引起腸上皮細(xì)胞低密度脂蛋白膽固醇受體(low-density l

12、iproprotein receptor，LDLR)蛋白表達(dá)呈上升趨勢(0.05＜P＜0.1)，膽固醇-27-羥固醇(sterol27-hydroxylase，CYP27A1)蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。肉雞的球蟲感染顯著上調(diào)十二指腸中靶向CYP27A1的miRNA1699、miRNA7477-5p、miRNA1451-5p(P＜0.05)和miRNA1608(P＜0.01)的表達(dá)量。此外，體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗(yàn)證miRNA1699和mi

13、RNA1608確實(shí)能結(jié)合到CYP27A1的3'UTR。球蟲感染引起的十二指腸腸上皮LDLR和CYP27A1蛋白表達(dá)的升高可能促進(jìn)小腸內(nèi)膽固醇的累積。我們研究還發(fā)現(xiàn)，miRNAs調(diào)控靶基因CYP27A1參與其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，胃腸道腸上皮細(xì)胞增殖與膽固醇代謝之間的緊密聯(lián)系以及球蟲感染引發(fā)小腸炎癥的代償性作用。
　　3.球蟲感染對(duì)內(nèi)雞肝臟和下丘腦膽固醇代謝的影響
　　肝臟是機(jī)體膽固醇代謝的主要場所，而腦內(nèi)膽固醇含量的穩(wěn)態(tài)是維持神經(jīng)細(xì)胞

14、正常生理功能的必要條件。為進(jìn)一步揭示球蟲感染降低血液中膽固醇含量的機(jī)制，采用real-time PCR和western blot技術(shù)檢測了肉雞肝臟和下丘腦組織中膽固醇代謝基因和蛋白水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，球蟲感染組肉雞肝臟和下丘腦組織中膽固醇和甘油三酯濃度無顯著變化。球蟲感染組肉雞肝臟中三磷酸腺苷綁定結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5(ATP-binding cassette trasproter proteins G5，ABCG5)、三磷酸腺苷綁定

15、結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8(ATP-binding cassette trasproter proteins G8，ABCG8)和LDLR基因表達(dá)均顯著下降(P＜0.05)，而LDLR蛋白表達(dá)無顯著變化;SREBP1和GR mRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，但蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，但羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)、CYP27A1和LDLR蛋