小干擾RNA抑制巨噬細(xì)胞游走抑制因子的表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的抑制作用.pdf

1、目的：巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)是一種多功能細(xì)胞因子，與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。本研究通過轉(zhuǎn)染靶向MIF基因的小干擾RNA(RNA，siRNA)，探討MIF基因沉默后對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響。 方法：選取90例胃癌組織標(biāo)本和78例癌旁正常組織標(biāo)本制作成組織芯片，然后用免疫組化(IHC)分析MIF在胃癌患者中的表達(dá)，結(jié)合腫瘤的臨床病理學(xué)資料，分析它們之間的相關(guān)性。設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)MIF不同位點(diǎn)的2對(duì)siRNA序列(MIF

2、si-1和MIF si—2)和1對(duì)無任何靶基因的siRNA做為陰性對(duì)照(NC)，用脂質(zhì)體Oligofectamine TM轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞以沉默MIF基因，另設(shè)一組(Mock組)只加脂質(zhì)體而無siRNA為對(duì)照組，以RT—PCR和Western blot分別檢測24h、48h和72h中MIF mRNA和蛋白的表達(dá)；通過噻唑藍(lán)(MTT)比色法、平板克隆實(shí)驗(yàn)和PCNA表達(dá)分析MIF沉默對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響；將AGS細(xì)胞用5-氟尿嘧啶(

3、5-FU)處理24h后，轉(zhuǎn)染siRNA，24h后收集細(xì)胞做Western blot，檢測MIF和PCNA蛋白水平。 結(jié)果：組織芯片用免疫組化分析后顯示胃癌組織MIF表達(dá)水平高于癌旁正常組織(P<0.001)；在胃癌組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1)MIF表達(dá)水平比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(NO)的高(P=0.043)。AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染MIF si-1、MIF si—2和NC比較，24h、48h、72h的MIF mRNA抑制率分別為為MIF si-16

4、2.83％、67.28％和76.91％，MIF si—256.65％、65.78％和73.86％；MIF蛋白抑制率為MIF si-171.00％、72.73％和76.51％，MIF si—262.94％、66.21％和73.55％。用RNA干擾沉默MIF基因后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MIFsi-1和MIF si—2轉(zhuǎn)染4天后細(xì)胞數(shù)分別為原來2.55±0.13倍和2.62±0.15倍，倍增時(shí)間分別為2.58±0.14天和2.42±0.17天，

5、而NC組和Mock組細(xì)胞數(shù)則為原來的4.21±0.32倍和4.33±0.48倍，倍增時(shí)間分別為1.25±0.06天和1.08±0.14天。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)MIF si-1和MIF si—2沉默MIF基因10天后，AGS細(xì)胞集落形成數(shù)為33.15±4.12個(gè)和43.25±2.63個(gè)，顯著低于陰性對(duì)照組的103.27±2.80個(gè)和未轉(zhuǎn)染組(Mock組)的112.50±2.10個(gè)(均P<0.001)。同時(shí)，MIF沉默后，PCNA表達(dá)下調(diào)

6、。AGS細(xì)胞用5-FU處理后，MIF表達(dá)水平比未處理的要高(灰度值47.51 vs40.80)；再分別對(duì)5-FU處理細(xì)胞行RNA干擾，對(duì)MIF基因表達(dá)的抑制率MIF si-1為65.83％和MIF si—2為61.97％:同時(shí)經(jīng)5-FU處理的AGS細(xì)胞PCNA表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論：MIF在胃癌組織中高表達(dá)，且與其臨床分期有關(guān)；沉默MIF基因后能抑制胃癌細(xì)胞AGS的增殖；MIF可能通過作用于胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞AGS的增殖