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1、第一部分 shRNA沉默PLCε基因?qū)δI癌786-0細(xì)胞增殖的抑制作用 目的:探討經(jīng)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)干擾技術(shù)沉默磷脂酶Cε(phosphol ipase C epsilon,PLCε)基因表達(dá)后對(duì)腎癌786-O細(xì)胞增殖的抑制作用。 方法:經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒(pGenesil-PLCε)和空質(zhì)粒(pGenesil-NP)轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后,通過RT-PCR檢測(cè)PLCε mR
2、NA的表達(dá);MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率;流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后細(xì)胞周期的變化。 結(jié)果:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后可明顯抑制PLCεmRNA的表達(dá),其抑制率為69.7%;轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后細(xì)胞增殖抑制率分別為21.2%,31.6%和32.7%;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后細(xì)胞周期的分布發(fā)生了改變,G0/G1期細(xì)胞增多,S期和G2/M期細(xì)胞減少,細(xì)胞阻滯于G0/G1期,并出現(xiàn)了亞二倍體“凋亡峰”。
3、結(jié)論:經(jīng)RNA干擾技術(shù)阻斷PLCε基因表達(dá)后可明顯抑制腎癌786-O細(xì)胞增殖,并使細(xì)胞周期分布發(fā)生改變,細(xì)胞增殖減緩,提示PLCε可作為腎癌基因治療的分子靶點(diǎn),為針對(duì)PLCε基因進(jìn)行腫瘤生物治療研究奠定了理論基礎(chǔ)。 第二部分 shRNA沉默PLCε基因抑制腎癌細(xì)胞增殖作用的機(jī)制 目的:探討經(jīng)shRNA沉默PLCε基因表達(dá)抑制腎癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。 方法:采用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法分析轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后P27和
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