1、microRNAs參與7,8-二氫二醇-9,10-環(huán)氧苯并(a)芘誘發(fā)的FL細胞應答反應研究;2、地塞米松誘導的DNA聚合酶β過表達和反義阻斷穩(wěn)定細胞系的建立.pdf

1、苯并(a)芘-7,8-二氫二醇-9,10-環(huán)氧化物(benzo(a)pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide,BPDE)是多環(huán)芳烴類(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)環(huán)境化學污染物苯并(a)芘(BaP)在體內經微粒體酶代謝活化的產物,被認為是BaP的終致癌物。BPDE具有親電性碳原子活性基團,能與組成核酸的堿基和組成蛋白質的氨基酸親核基團共價結合形成加合物,損傷生物大分子的結構

2、和功能。BPDE損傷不是一個細胞被動接受的過程,DNA損傷會激活細胞內核苷酸切除修復、細胞周期阻滯、激活低保真度的跨損傷復制等保護性機制,以及p53,PI-3K／Akt／JNKs,MAPKs／AP-1,IKKβ／NF-κB等信號通路被激活。
　　 為了全面了解細胞對BPDE的早期應答反應,揭示其致癌機制。本實驗室采用基因組學和蛋白質組學的方法,在全基因組和蛋白質水平對FL細胞在BPDE暴露后引起的早期細胞應答反應做了系統(tǒng)的研究.

3、采用Affymetrix HG-U133 Set(～33000個基因)全基因組芯片來篩選FL人羊膜上皮細胞BPDE處理后4 h的應答基因發(fā)現(xiàn),在基因表達水平引起1764個差異表達基因。這些BPDE的應答基因功能涉及廣泛,包括細胞周期調節(jié),轉錄調節(jié),RNA剪接、蛋白質／脂類代謝、細胞骨架、胞內運輸、細胞生長、凋亡、DNA修復和DNA損傷反應等；涉及的信號通路包括:p53、Ras／MAPK、Akt／PKB、PKC、Wnt和TGFbeta通路

4、等。應用蛋白質組學方法,對應答效應蛋白進行的研究中發(fā)現(xiàn)量效關系中有65個蛋白斑點在BPDE處理后12小時發(fā)生了顯著的變化.時效研究中一共有128個蛋白斑點的表達發(fā)生了改變。MALDI-TOF鑒定的結果表明,這些得到成功鑒定的蛋白質功能涉及面非常廣,包括轉錄調控,細胞周期,細胞增殖,信號轉導,細胞骨架,發(fā)育,代謝以及其他功能未明的等。全基因組芯片表達譜和蛋白組學的研究表明:BPDE作用后細胞內發(fā)生了廣泛的變化,揭示了細胞對BPDE應答機制

5、的復雜性。但是表達譜芯片結果發(fā)現(xiàn)有1764個基因表達發(fā)生改變,而蛋白質組學僅發(fā)現(xiàn)194個蛋白的改變,除去由于技術限制的原因,可能細胞內還存在翻譯水平抑制眾多基因表達的機制.對此問題的研究,引起我們濃厚的興趣。
　　 近年來的研究表明,MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中,由內源基因編碼的長度為～21-24核苷酸的非蛋白編碼單鏈小分子RNA,在基因轉錄后調節(jié)中起著的重要的作用。miRNA通過堿基配對介導序列特異

6、性的基因沉默作用,包括降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯.我們推測miRNA也參與了BPDE的早期細胞應答反應,為了證實這一想法,我們采用microRNA芯片和qRT-PCR研究了miRNA在BPDE早期暴露細胞應答中的作用。microRNA芯片分析采用聯(lián)川公司miRNA14.0版μParaflo(R)雙色標記微陣列芯片,分析了在0.5μM濃度BPDE處理后2小時組和DMSO對照組中miRNAs表達譜的變化。
　　 結果:與對

7、照組相比,在處理組表達改變的miRNA和miRNA*有41個(p<0.1),其中18個表達下調,23個表達上調。經統(tǒng)計學分析篩選出有顯著性差異表達的miRNAs有10個(p<0.05),其中上調的有5個,下調的有5個；miRNAs*有4個,其中上調2個,下調2個。qRT-PCR驗證芯片結果用Taqman miRNA qRT-PCR試劑盒,在芯片樣品和新處理樣品,驗證了顯著性表達差異的miRNAs中選出的7個miRNA。
　　 結

8、果:發(fā)現(xiàn)has-miR-509-5p是主要發(fā)生改變的miRNA基因(p<0.01),比對照表達上調1.8倍,與芯片結果相一致。
　　 Inhibtor抑制miR-509-5p基因在BPDE誘導的FL細胞中表達。
　　 將合成的miR-509-5p inhibitor寡核苷酸片段和對照寡核苷酸片段,轉染細胞培養(yǎng)72h后,分別用含BPDE或DMSO的無血清培養(yǎng)基處理2h,換新鮮全培養(yǎng)基培養(yǎng)液培養(yǎng)2h。收集細胞,TRIzol試

9、劑提取總RNA,qRT-PCR檢測miR-509-5p在各組中的表達。
　　 結果:轉染對照序列組不影響B(tài)PDE誘發(fā)的miR-509-5p基因表達上調,而轉染inhibtor組,DMSO處理細胞中miR-509-5p基因的表達被下調,與Control組DMSO處理細胞相比,抑制效率達60％(p<0.01)；BPDE處理不再誘導其表達的上調。miR-509-5p靶基因預測用靶基因預測軟件Target scan5.1預測miR-50

10、9-5p靶基因。結果:得到受miR-509-5p調控的靶基因265個。
　　 將預測結果與本實驗室全基因組篩出的有顯著性差異表達的基因進行配對分析,結果發(fā)現(xiàn)有65個共同的基因。從中挑選出CDC14、DOCK4、EIF5B、IGF1R、MEIS1、NF1、PRKCA、RREB1、RAD23B、TDG、TET1、等11個重要的靶基因,進行后續(xù)靶基因分析。qRT-PCR驗證篩出的miR-509-5p靶基因用Takara SYBR Gr

11、een qRT-PCR試劑盒,在芯片樣品、新處理樣品、轉染miR-509-5p基因inhibitor樣品,檢測分析挑選的11個靶基因的表達變化,找出受miR-509-5p調控的靶基因。
　　 結果:在芯片樣品和新處理樣品中CDC14、DOCK4、IGF1R、MEIS1、NF1、PRKCA、RREB1、RAD23B等8個基因在BPDE暴露后2h表達均顯著性下調(p<0.01).在miR-509-5p基因表達抑制樣品中,CDC14B

12、,DOCK4,IGF1R,MEIS1,NF1,PRKCA,RREB1等7個基因表達顯著上調(p<0.01),而RAD23B改變不明顯。
　　 結論:
　　 a.首次證實miRNAs參與了BPDE引起的FL細胞早期應答反應,確認miR-509-5p是FL細胞早期應答反應的miRNA。
　　 b.首次證實了mir-509-5p通過轉錄后調解節(jié)抑制靶基因CDC14B,DOCK4,IGF1R,MEIS1,NF1,PRKC

13、A,RREB1等的表達。這些基因功能涵蓋細胞骨架穩(wěn)定、信號轉導、細胞周期調控、DNA損傷修復、轉錄調控等。說明mir-509-5p在BPDE引起的FL細胞早期應答反應中起著重要作用,是細胞對BPDE早期應答的分子標志物。
　　 c.這些新的發(fā)現(xiàn)對了解BPDE致癌效應早期的分子機制提供了新的理論基礎。
　　 基因組持續(xù)受到各種內源性和外源性因子的損傷,為了保證正常的生長控制與遺傳信息DNA復制的準確性,修復這些損傷是保持基

14、因組穩(wěn)定性的關鍵。修復失敗則導致基因突變,進而增加細胞癌變的風險。其中DNA堿基修改,如脫氨,烷基化和氧化,或由于自發(fā)脫嘌呤形成的無嘌呤／嘧啶(AP)位點等損傷出現(xiàn)最頻繁。這些小的DNA損傷主要通過堿基切除修復(bage excision repair,BER)途徑來完成。DNA聚合酶β(DNA polymerageβ,polβ)是BER修復途徑中不可替代的酶,因此,polβ被認為在堿基損傷修復和基因組完整性的維持中其關鍵作用,實驗證明

15、polβ下調或polβ基因突變都會導致由于DNA修復缺陷的基因突變。然而,近年來的研究表明,polβ可能參與了廣泛的DNA代謝反應,包括DNA復制,重組,減數(shù)分裂和DNA跨損傷合成等,但在合成的DNA鏈上表現(xiàn)為高堿基錯配率。這種錯誤配對可能是由于polβ干擾了其他精確DNA聚合酶的正常功能,而其本身又缺乏3'→5'缺乏校對活性,使得其復制保真度下降,導致基因組不穩(wěn)定.因此,建立誘導型polβ穩(wěn)定高表達表達和表達下調細胞系,并利用建立的細

16、胞系,研究polβ生物學功能的變化,對了解DNA polβ表達改變引起的基因突變和基因組不穩(wěn)定機制具有重要的理論意義。
　　 在本研究中,我們構建了誘導型反義阻斷和表達DNAPolβ的真核表達載體,然后將構建的地塞米松(dexamethasone,DEX)誘導的真核表達載體pMAMneo-amp-pol-β-,pMAMneo-amp-pol-β+和對照pMAMneo-amp-,分別轉染FL細胞。轉染細胞用含400μg／LGene

17、ticin(G418)的MEM培養(yǎng)基篩選,直至細胞集落生成,挑取單集落擴大培養(yǎng),建立了FL-pMAMneo-amp-,FL-pol-β-和FL-pol-β+細胞系。建立的細胞系用DEX誘導72小時后的qRT-PCR和免疫印跡分析表明:FL-pol-β細胞中Polβ的表達比對照顯著下調,FL-pol-β+細胞中Polβ的表達比對照顯著上調。此外,MNNG的敏感性試驗表明:與對照相比,Polβ表達下調的FL-pol-β細胞對烷化劑MNNG.