反式二羥環(huán)氧苯并（a）芘高表達相關(guān)基因及其主要特性研究.pdf

1、苯并(a)芘(B[a]P)是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，系多環(huán)芳烴(PAHs)的代表物，在空氣、土壤、水及食物中均有它的存在。PAHs由有機物質(zhì)的高溫分解和不完全燃燒形成，也可由人類生產(chǎn)和生活活動產(chǎn)生以及自然生成。PAHs進入哺乳動物細胞后活化為高毒性的活性代謝中間物并可對細胞大分子(DNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì))造成不可逆的損傷。PAHs代表一類有毒化合物，能在體內(nèi)產(chǎn)生許多毒性反應(yīng)，包括細胞毒性、遺傳毒性、免疫毒性、致畸性、致癌性和神經(jīng)毒性等。

2、關(guān)于BaP的致癌性資料，主要來自流行病學研究和動物實驗研究，但人類方面尚缺乏有力的證據(jù)，因此，在WHO屬下的國際癌癥研究機構(gòu)在其公布的致癌因素清單中，將之歸入“對人類可能有致癌性”的一類因素中。故BaP對人類致癌性的證據(jù)有待充實，其致癌機制尤其是分子機制有待闡明。已知Bap可使某些原癌基因激活和抑癌基因失活，但這些變化并不具特異性，因為不少化學物質(zhì)對這些基因都具有類似作用，因而難以闡明BaP致癌代謝物BPDE的特異易感基因。因此，本文在

3、從基因組水平上的篩選→已知基因功能研究→未知基因全長克隆等方面對BPDE致癌的相關(guān)基因進行研究，為尋找環(huán)境致癌物的生物性標志提供依據(jù)，為腫瘤的基因預防、早期診斷提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)，為探索抗腫瘤分子生物學治療手段提供新的策略與途徑。現(xiàn)將結(jié)果報告如下： 本文有三部分組成：第一部分反式二羥環(huán)氧苯并(a)芘誘導的轉(zhuǎn)化和成瘤16HBE細胞基因的表達改變 目的：多環(huán)芳烴是環(huán)境中廣泛存在的污染物，苯并(a)芘(B[a]P)一直作為致癌

4、劑多環(huán)芳烴(PAH)的代表，反式-7，8-二羥-9，10-環(huán)氧苯并芘(反式-BPDE)可能是B[a]P的終致突變物和終致癌物，盡管己進行過一些研究，但其致癌的分子機制特別是相關(guān)敏感基因的研究仍不十分清楚，本研究以篩選反式-BPDE誘導轉(zhuǎn)化16HBE細胞以及成瘤16HBE細胞的差異表達基因，為其致癌的分子機制研究及生物性標志的篩選提供依據(jù)。 方法：分別以BPDE轉(zhuǎn)化和成瘤16HBE細胞cDNA為檢測子(tester)，正常16HB

5、E細胞cDNA為驅(qū)動子(driver)，應(yīng)用抑制性消減雜交方法構(gòu)建cDNA消減文庫，經(jīng)2次消減雜交和2次PCR后，將巢式PCR產(chǎn)物插入TA載體克隆，隨機挑選克隆進行鑒定和測序，并用斑點雜交法驗證序列的同源性，將所得序列進行GenBank的BLAST和生物信息學分析。 結(jié)果：抑制性消減雜交試驗結(jié)果的電泳圖顯示消減組有明顯的條帶富集，未消減組看不到明顯的條帶，說明消減組有差異表達基因被擴增。將這些差異表達的基因克隆、測序、分析后，在

6、BPDE轉(zhuǎn)化細胞中發(fā)現(xiàn)了7個高表達的基因，為翻譯延長因子1α1、線粒體基因、溶解物載體家族25、EphA2、酪氨酸-3-加單氧酶/色氨酸-5-加單氧酶活化蛋白、乳酸脫氫酶A、TRIM28等，尚有一條在GenBank的已知基因中找不到對應(yīng)序列，在EST序列中找到全長對應(yīng)序列；在成瘤細胞中有8條已知的基因高表達，它們是：真核生物翻譯延長因子1α1，HIF-1反應(yīng)性RTP801，核糖體蛋白L10(RPL10)，核糖體蛋白S29(RPS29)，

7、線粒體相關(guān)的幾個基因，層粘連蛋白受體1(67LR1)，其一致性均達到99％以上；另有2條差異表達的cDNA片斷在已知基因中未找到對應(yīng)序列，在EST中找到對應(yīng)序列。 結(jié)論：初步篩選了在轉(zhuǎn)化和成瘤16HBE細胞中高表達的基因，為其功能的進一步研究提供了基礎(chǔ)資料；發(fā)現(xiàn)的高表達基因可能在BPDE的轉(zhuǎn)化和致癌機制中起作用，另外，可能有未知基因與BPDE的轉(zhuǎn)化和成瘤作用有關(guān)，為新基因的全長克隆和功能研究提供了基礎(chǔ)資料。 第二部分反式

8、二羥環(huán)氧苯并(a)芘高表達相關(guān)基因67LR1和eTEF1α1的主要特性研究 目的：67LR1及eTEF1α1基因是在第一部分研究的基礎(chǔ)上，篩選出的與反式-BPDE相關(guān)的基因，雖然已進行過一些研究，但其在致癌機制中所起的作用仍不清楚，本部分是為了探討67LR1及eTEF1α1基因在反式-BPDE轉(zhuǎn)化及致癌機制中的作用，為反式-BPDE相關(guān)基因的功能研究及其惡性轉(zhuǎn)化的生物性標志的篩選提供依據(jù)。 方法：從GenBank調(diào)出67

9、LR1及eTEF1α1基因全長，設(shè)計引物，采用RT-PCR方法擴增67LR1和eTEF1α1基因全長，插入pcDNATM3.1DirectionalTOPO表達載體，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染介導的技術(shù)和/或G418細胞篩選法轉(zhuǎn)染16HBE細胞，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因67LR1和eTEF1α1的瞬時和(或)穩(wěn)定表達的細胞株。用半定量RT-PCR方法分析轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物，對瞬時轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因67LR1細胞株，應(yīng)用含8064個基因點的微芯公司基因表達譜芯片CSC-GE-

10、80與雙熒光標記樣品與芯片雜交和掃描、圖像數(shù)據(jù)分析等一系列處理進行表達譜分析；對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染67LR1和eTEF1α1基因的細胞株，進行了雙層軟瓊脂試驗，并對轉(zhuǎn)基因67LR1的細胞株進行了裸鼠接種試驗。 結(jié)果：成功擴增出67LR1和eTEF1α1基因全長，構(gòu)建出瞬時和(或)穩(wěn)定表達67LR1和eTEF1α1的細胞株。對瞬時轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因67LR1細胞株的表達譜分析，兩組相比發(fā)生了顯著性表達變化的基因有295個，其中表現(xiàn)為上調(diào)的基因有1

11、45個，下調(diào)表達的基因有150個。在發(fā)生了顯著性表達改變的基因中，比較有明顯功能分類特征的包括與信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的基因，與腫瘤相關(guān)的基因，與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因以及與蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關(guān)的基因等。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染67LR1和eTEF1α1基因的細胞株，均能在雙層軟瓊脂中形成克隆。轉(zhuǎn)基因67LR1的細胞株在本次實驗中尚不能使裸鼠成瘤。 結(jié)論：67LR1基因功能涉及到信號轉(zhuǎn)導，腫瘤相關(guān)基因等方面，相關(guān)基因的表達變化具有復雜性，復雜的信號傳導網(wǎng)絡(luò)的紊

12、亂與Ras通路有關(guān)。eTEF1α1和67LR1均與反式-BPDE的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，提示67LR1和eTEF1α1基因作為反式-BPDE惡性轉(zhuǎn)化的生物性標志的可能性，亦提示將67LR1和eTEF1α1作為腫瘤化學預防和治療的靶分子的可能性。 第三部分反式二羥環(huán)氧苯并(a)芘相關(guān)新基因brg的全長克隆 目的：在第一部分的研究中，發(fā)現(xiàn)16HBE-C細胞表達變化的基因中有未知基因參與(EST)，因其與BPDE有關(guān)，所以命名為brg

13、(anti-BPDErelatedgene)基因。本研究應(yīng)用cDNA末端快速擴增法(rapidamplificationofcDNAends，RACE)擴增此未知基因的全長，以進行下一步的基因功能研究。 方法：應(yīng)用cDNA末端快速擴增法(RACE技術(shù))，對3’和5’端分別設(shè)計了梯度PCR，巢式PCR等優(yōu)化程序，以獲得特異的產(chǎn)物，然后對特異產(chǎn)物直接測序，將測序結(jié)果進行生物信息學分析，基因拼接等獲得新基因brg全長。 結(jié)果：

14、用RACE方法，經(jīng)優(yōu)化后的程序，3’和5’端均成功獲得特異性產(chǎn)物，3’RACE測序為394bp，有明顯的PolyA加尾信號，有編碼區(qū)的終止密碼子；5’RACE測序為1017bp，有起始密碼子ATG，其中197bp為3’和5’全長共有序列。將3’和5’序列拼接，結(jié)果全長1214bp，生物信息學分析brg基因閱讀框1032bp，編碼344個氨基酸。 結(jié)論：所得結(jié)果與設(shè)計一致，說明這一技術(shù)路線是簡便可行的，brg基因可能在反式二羥環(huán)氧