RNAi CyclinE對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期的影響.pdf

1、背景與目的:細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)失控被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。cyclin E是周期蛋白的一種,它能夠與CDK2一起促進(jìn)細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換。研究發(fā)現(xiàn)異常情況下,由于cyclin E無(wú)順序無(wú)規(guī)律的過(guò)度表達(dá),cyclin E可持續(xù)存在于整個(gè)細(xì)胞周期中,不斷激活CDK2和磷酸化pRb,驅(qū)使細(xì)胞超越控制機(jī)制發(fā)生異常增殖,引起腫瘤的發(fā)生。此外,cyclin E在細(xì)胞內(nèi)的積累也會(huì)導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性(chromosome i

2、nstability, CIN),最終引起腫瘤的發(fā)生。研究表明cyclin E的過(guò)表達(dá)同中心體的高增殖密切相關(guān),提示cyclin E持續(xù)的過(guò)表達(dá)可引起中心體的異常增殖,擾亂有絲分裂,從而導(dǎo)致早期癌變的發(fā)生。研究表明,cyclin E與肝癌的發(fā)生可能相關(guān)。肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,我國(guó)是肝癌的高發(fā)區(qū),每年發(fā)病人數(shù)超過(guò)全世界肝癌死亡人數(shù)的50％,是中國(guó)第2位的腫瘤死亡原因

3、。臨床實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明,肝癌患者癌組織中的cyclin E表達(dá)增加,而且研究也發(fā)現(xiàn)cyclin E的表達(dá)與肝癌的分化程度、侵襲性和臨床分級(jí)可能相關(guān)。綜合cyclin E對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控特點(diǎn)和cyclin E與肝癌之間的關(guān)系,筆者利用RNA干擾技術(shù),通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)染針對(duì)cyclin E的siRNA載體,降低肝癌HepG2細(xì)胞中cyclin E的表達(dá)水平,觀測(cè)降低肝癌組織中cyclin E的表達(dá)水平對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期的影響。
　

4、　方法:根據(jù)siRNA目標(biāo)序列的選取原則,設(shè)計(jì)并合成2對(duì)cyclin E基因靶向siRNA序列的DNA單鏈,退火成雙鏈發(fā)卡樣DNA;將其重組入siRNA載體pGFP-V-RS;得到重組子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122;對(duì)重組子的插入序列進(jìn)行DNA序列測(cè)定,并與設(shè)計(jì)序列做同源性比較。利用脂質(zhì)體LipofectAmineTM2000包裹,將pGFP-V-RS-siCE951、pGFP-V-RS-si

5、CE1122和pGFP-V-Con分別轉(zhuǎn)入人肝癌HepG2細(xì)胞中,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒僅加轉(zhuǎn)染試劑)。RT-PCR和Western-Blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞HepG2mRNA和蛋白表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期,CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞的增殖,軟瓊脂克隆形成檢測(cè)胞克隆形成能力。
　　結(jié)果:1.經(jīng)過(guò)同源性檢索和優(yōu)選確定951-969位(GCAAAAGG TTTCAGGGTAT)、1122-1140位(GGA

6、CAAAGCCCGAGCAAAG)為siRNA靶序列。
　　2.篩選得到重組子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122,測(cè)序分析其插入序列與設(shè)計(jì)完全一致。
　　3.干擾1組(轉(zhuǎn)染pGFP-V-RS-siCE951)和干擾2組(轉(zhuǎn)染pGFP-V-RS-siCE1122)細(xì)胞cyclin E mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.215±0.021和0.178±0.019,顯著低于空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)siRN

7、A對(duì)照組(分別為0.406±0.037和0.372±0.042,p＜0.05);在空白對(duì)照組與無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組之間,cyclin E mRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。
　　4.空白對(duì)照組、無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組、干擾1組和干擾2組細(xì)胞在大約54KD處均有免疫印跡出現(xiàn),其中空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組的免疫印跡顯著強(qiáng)于干擾1組和干擾2組。
　　5.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,干擾1組和干擾2組與空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)s

8、iRNA對(duì)照組比較,在3d、4d、5d細(xì)胞孔內(nèi)的吸光度值顯著減少,差異有顯著性(p＜0.05)。
　　6.空白對(duì)照組與無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組比較,各期細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異(p＞0.05),;干擾1組和干擾2組的各期細(xì)胞比例與空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組比較,S和G2/M期細(xì)胞比例減少,GO/G1期細(xì)胞比例增加,有顯著性差異(p＜0.05)。
　　7.軟瓊脂集落形成能力實(shí)驗(yàn)顯示,干擾1組和干擾2組平均集落形成數(shù)為124.6±

9、16.3和141.2±15.2,顯著低于無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組和空白對(duì)照組(分別為209.2±25.8和226.7±34.2,p＜0.05);空白對(duì)照組與無(wú)關(guān)siRNA對(duì)照組平均集落形成數(shù)比較,差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。
　　結(jié)論:1. cyclin E951-969位(GCAAAAGGTTTCAGGGTAT)、1122-1140位(GGACAAAGCCCGAGCAAAG)為靶區(qū)段,構(gòu)建的siRNA載體pGFP-V-RS-siC