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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
目前急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)已成為我國(guó)城市和農(nóng)村人口死亡的主要原因之一,且發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。急性冠脈綜合征包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)、不穩(wěn)定型心絞痛(unstableangina pectoris,UAP)、心源性猝死,死亡率較高。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)與急性冠脈綜合征的發(fā)生密
2、切相關(guān)。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是一種血管壁的炎癥進(jìn)展性疾病,單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶不斷聚集,使斑塊的纖維帽降解,引起斑塊不穩(wěn)定,不穩(wěn)定斑塊破裂是導(dǎo)致急性冠脈綜合征的一個(gè)重要原因。
白三烯B4(LTB4)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中是一種功能強(qiáng)大的趨化因子和炎癥介質(zhì),它是花生四烯酸通過(guò)5-脂氧合酶(5-LO)的作用產(chǎn)生的炎性脂質(zhì)介質(zhì)。ERK信號(hào)通路阻滯劑PD98059能顯著降低LTB4的抗凋亡作用。白
3、三烯能上調(diào)斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotenase-2,MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotenase-9,MMP-9)表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊不穩(wěn)定、破裂。
EMMPRIN(細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子)也稱為CD147,是一種有兩個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的跨膜糖蛋白,它最初在許多腫瘤細(xì)胞的表面上被發(fā)現(xiàn),能在成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞上誘導(dǎo)MMPs合成,很多研究證
4、實(shí),在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞,如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(SMC)上都可發(fā)現(xiàn)EMMPRIN高度表達(dá),也可以增加血小板活性,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。在不同時(shí)間段用NIM811抑制EMMPRIN后發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達(dá)量顯著減少,同樣的,在泡沫細(xì)胞中,EMMPRIN的增加使MMP-9的表達(dá)量顯著增加,EMMPRIN在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中和載脂蛋白E(ApoE)基因缺陷小鼠中被發(fā)現(xiàn)高表達(dá),這些結(jié)果表明,E刪PRIN在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑
5、塊不穩(wěn)定的過(guò)程中起著重要的作用。
到目前為止,三種不同的絲裂原活化蛋白激酶途徑(MAPK)已經(jīng)被確定,即ERK1/2、P38、JNK/SAPK。許多研究證實(shí),絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)在炎癥方面起著重要的作用。
國(guó)內(nèi)外研究和我們前期研究均顯示LTB4能增加MMPs的表達(dá),但是否通過(guò)MAPKs途徑增加EMMPRIN表達(dá),進(jìn)而增加MMPs的表達(dá),國(guó)內(nèi)外研究尚未有直接證據(jù)。
目的:
6、 探討白三烯B4在MAPK信號(hào)通路中對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)表達(dá)的影響。
方法:
細(xì)胞培養(yǎng)人類單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清,10mM HEPES。
細(xì)胞處理在2-6組THP-1細(xì)胞中加入終濃度為100nM的PMA,在37℃,5%CO2環(huán)境中繼續(xù)孵育24h,使懸浮生長(zhǎng)的單核細(xì)胞分化成貼壁生
7、長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞。4-6組分別加入終濃度為20uM的PD98059,SB203580,SP600125培養(yǎng)箱孵育1小時(shí)后3-6組分別加入終濃度為100nM的LTB4,繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育24h。
明膠酶譜法(gelatinzymography)測(cè)定MMP-9的活性MMP-9為EMMPRIN的下游產(chǎn)物,通過(guò)MMP-9的活性變化來(lái)反映EMMPRIN的表達(dá)變化。6組分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清液各10ul與上樣緩沖液混合,經(jīng)含0.1%明膠的SDS凝
8、膠行非變性垂直電泳(120V,100min),至溴酚藍(lán)跑至底部,膠置2.5%TritonX-100中室溫震蕩孵育15min×2次。換用孵育液(0.05M Tris-HCl PH8.8,5mMCaCl,0.02%NaN3),37℃中孵育16-20h,使用0.1%(w/v)的考馬斯亮藍(lán)R-250染色30-40min,脫色液[甲醇-冰醋酸-水(45∶10∶45)]脫色。
RNA抽提和RT-PCR半定量分析用Trizol試劑提取總
9、RNA,加入隨機(jī)引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以cDNA為模板,PCR分別擴(kuò)增EMMPRIN、MMP-9,設(shè)β-actin作為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,于BIO-RAD Gel2000凝膠成像儀上成像,Quantity One(BIO-RAD)軟件作半定量分析。(EMMPRIN,上游引物:5'-GGTCACAGGGCACCGCTGGCT-3'下游引物:5'-CGGCCTCCATGTTCAGGTTCTCAA-3'; M
10、MP-9,上游引物:5'-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3'下游引物:5'-CCCTCAGTGAAGCGGTACAT-3';β-actin,上游引物:5'-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3'下游引物:5'-GTCAGGCACGATTTCCCGCT-3')蛋白抽提和Western blot分析細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷PBS(PH7.4)沖洗后,加入4℃預(yù)冷的RIPA裂解液和PMSF,在冰上裂解30-60min,4℃,12000r
11、pm離心30min,提取的蛋白進(jìn)行BCA蛋白定量,與2×上樣緩沖液煮沸變性5min。在10%SDS-PAGE膠中每孔加入總蛋白20ug進(jìn)行垂直電泳(120V,90min),半干轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD)轉(zhuǎn)膜(15V,38min),5%脫脂牛奶-TBST室溫封閉2h,5%脫脂牛奶-TBST稀釋EMMPRIN一抗(1∶1000)4℃輕搖過(guò)夜,二抗(1∶5000)室溫孵育1.5h后用化學(xué)發(fā)光顯色劑(Amersham)顯色,感光、洗片。將所得照片
12、掃描,輸入計(jì)算機(jī),用Quantity one軟件掃描得吸光度值,以EMMPRIN、β-actin平均吸光度比值做定量分析。
結(jié)果:
1.THP-1細(xì)胞的上清液中MMP-9的活性極其微弱,幾乎沒(méi)有,THP-1細(xì)胞經(jīng)過(guò)PMA誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后MMP-9活性明顯增加,但是加入LTB4的巨噬細(xì)胞組(3組)與不加LTB4的巨噬細(xì)胞組(2組)相比,MMP-9活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),加入PD98059阻斷ERK1/
13、2通路后,MMP-9的活性較第3組明顯減少(p<0.01),加入SB203580阻斷P38通路后,MMP-9的活性較第3組明顯減少(p<0.01),加入SP600125后阻斷JNK通路后,MMP-9的活性較第3組明顯減少(p<0.05)。
2.THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后,EMMPRIN的mRNA表達(dá)量增加,但與1組相比,并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,加入LTB4的巨噬細(xì)胞組與不加LTB4的巨噬細(xì)胞組相比,加入LTB4的巨噬細(xì)
14、胞組的EMMPRIN的mRNA表達(dá)量明顯增加(p<0.05),加入PD98059阻斷ERK1/2通路后,EMMPRIN的mRNA表達(dá)量較第3組明顯減少(p<0.01),加入SB203580阻斷P38通路后,EMMPRIN的mRNA表達(dá)量較第3組明顯減少(p<0.01),加入SP600125后阻斷JNK通路后,EMMPRIN的mRNA表達(dá)量較第3組明顯減少(p<0.05)。
3.THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后,MMP
15、-9的mRNA表達(dá)量較THP-1細(xì)胞組明顯增加(p<0.01),加入LTB4的巨噬細(xì)胞組與不加LTB4的巨噬細(xì)胞組相比,加入LTB4的巨噬細(xì)胞組的MMP-9的mRNA表達(dá)量明顯增加(p<0.01),加入PD98059阻斷ERK1/2通路后,MMP-9的mRNA表達(dá)量較第3組明顯減少(p<0.01),加入SB203580阻斷P38通路后,MMP-9的mRNA表達(dá)量較第3組明顯減少(p<0.01),加入SP600125后阻斷JNK通路后,M
16、MP-9的mRNA表達(dá)量較第3組明顯減少(p<0.01)。
4.THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后,EMMPRIN的蛋白表達(dá)量較THP-1細(xì)胞組明顯增加(p<0.01),加入LTB4的巨噬細(xì)胞組與不加LTB4的巨噬細(xì)胞組相比,加入LTB4的巨噬細(xì)胞組EMMPRIN的蛋白表達(dá)量明顯增加(p<0.01),加入PD98059阻斷ERK1/2通路后,EMMPRIN的蛋白表達(dá)量較第3組明顯減少(p<0.01),加入SB20358
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