慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹及Kearns-Sayre綜合征患者線粒體DNA突變的研究.pdf

1、目的： 近年來(lái)，人們?cè)诰€粒體呼吸鏈缺乏而引起的疾病，特別是CPEO的患者的肌肉組織和其他多種組織中發(fā)現(xiàn)有大片段的線粒體DNA缺失。許多研究表明這些缺失是這類(lèi)疾病的重要病因。本實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)11例慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹及Kearns-Sayre綜合征患者骨骼肌細(xì)胞的線粒體DNA的缺失情況。 方法： 從11例慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹和Kearns—Sayre綜合征患者的骨骼肌活檢標(biāo)本中，提取總體DNA。根據(jù)限制性內(nèi)切酶PvuⅡ

2、使用說(shuō)明，取1μgDNA，加入2個(gè)單位的酶，37℃下，在終體積為20μl的反應(yīng)體系中消化1小時(shí)(酶切位點(diǎn)在2654)，使DNA線性化。將DNA片段加入濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠中，與入-Hind Ⅲ digest marker同時(shí)電泳，至marker移至膠的中部停止電泳，使DNA片段按大小分離。將瓊脂糖凝膠在0.2M HCl中浸泡8min使DNA脫嘌呤，然后浸入變性液中浸泡2×15min使DNA變性，再浸入中和液中浸泡2×15min使之

3、中和。使用20×SSC轉(zhuǎn)移液，采用毛細(xì)轉(zhuǎn)移法將凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移至正電荷尼龍膜上。使用線粒體/胞質(zhì)病毒。DNA純化試劑盒從正常人全血中提取全長(zhǎng)線粒體DNA作為探針，使用地高辛高效標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒進(jìn)行地高辛-dUTP標(biāo)記，并與正電荷尼龍膜進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、雜交后沖洗及顯色反應(yīng)。 結(jié)果： 正常對(duì)照的標(biāo)本只出現(xiàn)一條16.5kb的雜交帶。ll例CPEO及KSS患者在16.5kb處也均有一條雜交帶。有7例患者除一條正常大小雜交帶外