MicroRNA-133a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的功能研究.pdf

1、第一部分MiRNA-133a影響血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞樣分化的研究
　　 目的:研究miRNA-133 a(miR-133a)在小鼠血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化中的作用。
　　 方法:用Northem免疫印跡法檢測(cè)miR-133a在小鼠心臟、骨骼肌、血管平滑肌細(xì)胞、胸主動(dòng)脈中的表達(dá)情況。用β-甘油磷酸鈉(β-sodium glycerophosphate，β-GP)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化，Norther

2、n免疫印跡法檢測(cè)miR-133a在這一過(guò)程中的表達(dá)水平的改變。觀察成骨樣細(xì)胞分化指標(biāo)變化:堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性用分光光度計(jì)檢測(cè)對(duì)硝基苯酚釋放獲得，骨鈣素(Osteocalcin，OC)用放射免疫測(cè)定法測(cè)定，而細(xì)胞經(jīng)茜素紅染色后，用氯化十六烷基嘧啶提取染色茜素紅量化礦化結(jié)節(jié)染色。Westem免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)Runx2蛋白和mRNA表達(dá)量的變化。根據(jù)miR-133a-1前體序列設(shè)

3、計(jì)引物，退火后連接至pSilencer4.1-CMV puro載體，構(gòu)建miR-133a-1的表達(dá)載體pre-miR-133a-1。將pre-miR-133a-1轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞，造成miR-133a過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，隨后予10mMβ-GP誘導(dǎo)分化，同樣方法檢測(cè)ALP活性、OC分泌以及細(xì)胞中礦化結(jié)節(jié)量的變化，Runx2蛋白用Western免疫印跡法檢測(cè)，Runx2 mRNA表達(dá)用Northern免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

4、　　 結(jié)果:(1) miR-133a在心臟及骨骼肌組織中有較高水平的表達(dá)，而在VSMCs和胸主動(dòng)脈中少量表達(dá)。(2)與對(duì)照組相比，β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過(guò)程中，ALP活性及OC分泌水平均明顯增加，Runx2蛋白表達(dá)水平顯著升高，且礦化結(jié)節(jié)形成也明顯增多。(3)與轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒的VSMCs相比，轉(zhuǎn)染了pre-miR-133a-1的VSMCs中的miR-133a表達(dá)水平顯著增加，ALP的活性和骨泌素的分泌量及礦化

5、結(jié)節(jié)的生成隨著miR-133a的過(guò)表達(dá)而明顯下降。miR-133a的過(guò)表達(dá)抑制了Runx2蛋白的表達(dá)，而Runx2mRNA的表達(dá)水平卻未受影響。
　　 結(jié)論:用pSilencer4.1-CMV puro質(zhì)粒構(gòu)建成功miR-133a-1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染該載體可以使miR-133a在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地高表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-133a抑制血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化。
　　 第二部分 MiR-133a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞向成骨

6、樣細(xì)胞分化的機(jī)制研究
　　 目的:預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-133a作用的靶基因，為防治動(dòng)脈鈣化提供理論依據(jù)。
　　 方法:用多個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件分析得到miR-133a作用的靶基因。PCR擴(kuò)增包含靶位點(diǎn)在內(nèi)的靶基因3’-UTR，PCR擴(kuò)增靶基因3，-UTR全長(zhǎng)cDNA，連接到pcDNA3.1(+)載體構(gòu)建野生型靶基因3’-UTR表達(dá)載體，以此為模板，用QuickChange site-directed mutagenesis試劑

7、盒靶基因3'UTR中引入三個(gè)堿基突變，構(gòu)建突變型靶基因3’-UTR表達(dá)載體，這兩個(gè)載體分別與pre-miR-133a-1或miR-control共同轉(zhuǎn)染，加β-GP誘導(dǎo)分化，觀察靶基因蛋白表達(dá)，靶基因蛋白表達(dá)用Western免疫印跡法檢測(cè)。
　　 結(jié)果:(1)軟件預(yù)測(cè)Runx2為miR-133a作用的靶基因。(2)轉(zhuǎn)染入含突變型Runx23’-UTR結(jié)合位點(diǎn)的載體可以消除pre-miR-133a-1對(duì)Runx2蛋白表達(dá)的抑制，提