低氧誘導(dǎo)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向冠脈血管平滑肌細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、冠脈血管平滑肌細(xì)胞在冠脈血管的發(fā)育及冠心病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。明確冠脈血管平滑肌細(xì)胞的起源及其分化機(jī)制有助于使其更好地應(yīng)用于先天性冠脈血管病變的預(yù)防以及冠脈血管再生等領(lǐng)域。目前認(rèn)為胚胎心外膜祖細(xì)胞是冠脈血管平滑肌細(xì)胞的主要來(lái)源之一。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是不同心外膜祖細(xì)胞群從心外膜遷移入胚胎心臟并最終分化為心系細(xì)胞的主要機(jī)制。多種信號(hào)通路可調(diào)控心外膜祖細(xì)胞經(jīng)EMT轉(zhuǎn)化向冠脈血管平滑肌細(xì)胞的分化過(guò)程。胚胎心外膜祖細(xì)胞是一個(gè)表達(dá) T

2、bx18、Wt1、Tcf21等多種標(biāo)記基因的祖細(xì)胞池。轉(zhuǎn)錄因子 Tbx18在哺乳動(dòng)物胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用?；蜃V系示蹤技術(shù)證實(shí)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞是一群具有向冠脈血管平滑肌細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞分化的祖細(xì)胞亞群。胚胎心血管系統(tǒng)的發(fā)育是在低氧微環(huán)境中進(jìn)行的。低氧誘導(dǎo)因子 HIF-1α是低氧信號(hào)的關(guān)鍵上游因子，參與調(diào)控冠脈血管形成發(fā)育。并且低氧能夠通過(guò)HIF-1α調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞等的EMT轉(zhuǎn)化過(guò)程。低氧誘導(dǎo)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，并促進(jìn)冠脈

3、循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育。研究表明敲除HIF-1α?xí)?dǎo)致冠脈血管畸形、間質(zhì)細(xì)胞死亡、心臟環(huán)化異常等改變。1因此，明確低氧對(duì)Tbx18+心外膜細(xì)胞向冠脈血管平滑肌細(xì)胞分化的作用及相關(guān)機(jī)制具有重要的臨床意義。
　　基因譜系示蹤技術(shù)在胚胎發(fā)育研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本研究通過(guò)構(gòu)建Tbx18：Cre/R26REYFP和 Tbx18：Cre/R26RLacz兩種Tbx18基因譜系示蹤模型，并通過(guò)體外低氧干預(yù)由該模型示蹤培養(yǎng)的Tbx18+心外膜祖細(xì)胞，以及在

4、體構(gòu)建E14.5天胚胎心外膜低氧模型，探討低氧對(duì)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向冠脈血管平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用及其主要調(diào)控機(jī)制。
　　第一部分:通過(guò)譜系示蹤模型培養(yǎng)體外示蹤的Tbx18+心外膜祖細(xì)胞
　　目的：探討通過(guò)構(gòu)建Tbx18基因譜系示蹤模型培養(yǎng)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的方法，為體外研究Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：雄性Tbx18：Cre小鼠以及Cre報(bào)告小鼠分別與C57BL/6雌性小鼠交配

5、，經(jīng)基因型鑒定并篩選出雜合子后代繁殖。雜合子狀態(tài)的Tbx18：Cre雌性小鼠分別與R26REYFP、R26RLacz雄性小鼠以3:2比例交配，提取胎鼠基因組并通過(guò)基因型鑒定篩選出 Tbx18基因譜系示蹤模型。通過(guò) E11.5天 Tbx18：Cre/R26REYFP/Lacz雙雜合示蹤胎鼠心臟建立命運(yùn)示蹤的Tbx18+心外膜祖細(xì)胞體外培養(yǎng)模型。觀察培養(yǎng)細(xì)胞的自身特性，并通過(guò)熒光顯微鏡及Lacz染色技術(shù)觀察Tbx18+心外膜祖細(xì)胞特異的 Y

6、FP熒光和 Lacz染色；通過(guò)免疫熒光和 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Tbx18基因的表達(dá)，明確獲取細(xì)胞的純度。
　　結(jié)果：成功繁殖Tbx18：Cre小鼠及Cre報(bào)告小鼠，并建立Tbx18基因命運(yùn)示蹤模型。通過(guò) Tbx18：Cre/R26REYFP/Lacz示蹤模型培養(yǎng)出體外示蹤的Tbx18+心外膜祖細(xì)胞群。其中，通過(guò)Tbx18:Cre/R26REYFP示蹤模型培養(yǎng)出的Tbx18+心外膜祖細(xì)胞在熒光顯微鏡下表達(dá)特異的綠色熒光，而通過(guò) T

7、bx18:Cre/R26RLacz示蹤模型培養(yǎng)出的 Tbx18+心外膜祖細(xì)胞Lacz染色呈深藍(lán)色。
　　結(jié)論：通過(guò)基因譜系示蹤技術(shù)培養(yǎng)的Tbx18+心外膜祖細(xì)胞方法相對(duì)簡(jiǎn)單、細(xì)胞純度高。Tbx18+心外膜祖細(xì)胞從心臟表面直接爬出后形成的細(xì)胞群形態(tài)和排列均與其在心臟表面近似，有利于Tbx18+心外膜祖細(xì)胞分化機(jī)制的后續(xù)研究。
　　第二部分:體外低氧誘導(dǎo)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向冠脈血管平滑肌細(xì)胞的分化
　　目的：探討低氧

8、信號(hào)誘導(dǎo)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向冠脈血管平滑肌細(xì)胞的分化及相關(guān)機(jī)制
　　方法：通過(guò)氯化鈷誘導(dǎo)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的低氧反應(yīng)。分別通過(guò)熒光共聚焦和免疫組化觀察低氧干預(yù)后 Tbx18：Cre/R26REYFP/Lacz示蹤的Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和Myh11的表達(dá)。分別觀察細(xì)胞在低氧組、常氧組、低氧HIF-1α阻斷組、對(duì)照組培養(yǎng)后，Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向冠脈血管平滑肌細(xì)胞分化的比例的差異。通過(guò)免

9、疫熒光和qRT-PCR方法觀察低氧干預(yù)及阻斷HIF-1α后Tbx18+心外膜祖細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)指標(biāo)的變化。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞遷移能力的差異。
　　結(jié)果：低氧干預(yù)誘導(dǎo)了Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向冠脈血管平滑肌細(xì)胞的分化。隨著低氧干預(yù)的時(shí)間延長(zhǎng)，分化比例逐漸升高；而阻斷HIF-1α后，低氧誘導(dǎo)的分化比例明顯下降。低氧干預(yù)使Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的ZO-1表達(dá)下降，Snail表達(dá)升高；阻斷HIF-1α后，抑制了低

10、氧對(duì)ZO-1及Snail表達(dá)的影響。低氧干預(yù)促進(jìn)了Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)論：低氧干預(yù)能誘導(dǎo)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向冠脈血管平滑肌細(xì)胞的分化。低氧的誘導(dǎo)分化作用主要是通過(guò)HIF-1α調(diào)控該細(xì)胞的EMT過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Snail是低氧狀態(tài)下HIF-1α的下游作用因子。
　　第三部分：構(gòu)建在體心外膜低氧模型并誘導(dǎo)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的提前分化
　　目的：在組織水平明確Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向冠脈血

11、管平滑肌細(xì)胞分化的潛能。探討在體誘導(dǎo)心外膜低氧對(duì)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞分化的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：通過(guò)Tbx18：Cre/R26REYFP/Lacz命運(yùn)示蹤模型在體觀察Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向冠脈血管平滑肌細(xì)胞的分化。通過(guò)孕鼠持續(xù)吸入低氧（15％O2濃度）的方法構(gòu)建 E14.5天胎鼠心外膜低氧模型，并用低氧探針觀察心外膜低氧狀態(tài)隨時(shí)間的改變。通過(guò)熒光共聚焦技術(shù)觀察α-SMA、Myh11等血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物以及snail

12、、sulg等EMT調(diào)節(jié)因子在E14.5天胚胎心外膜低氧模型Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的表達(dá)。通過(guò) Lacz染色觀察低氧干預(yù)后 Tbx18+心外膜祖細(xì)胞及其衍化細(xì)胞的遷移改變。
　　結(jié)果：免疫熒光顯示血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和Myh11均在 E16.5和新生小鼠冠脈血管壁與 Tbx18：Cre/ R26REYFP示蹤小鼠的YFP熒光共聚焦。E18.5天Tbx18：Cre/R26RLacZ示蹤小鼠的心臟Lacz染色結(jié)果顯示，冠脈血

13、管壁細(xì)胞Lacz染色呈陽(yáng)性。低氧探針及HIF-1α的免疫熒光顯示孕鼠吸入低氧后3小時(shí) E14.5天胎鼠心外膜開(kāi)始出現(xiàn)低氧。并且隨著孕鼠吸入低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，心外膜持續(xù)性處于低氧微環(huán)境。低氧模型小鼠的部分 Tbx18+心外膜祖細(xì)胞表達(dá)α-SMA、Myh11和snail。與常氧組比較，低氧干預(yù)對(duì)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞及其衍化細(xì)胞的分布無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：譜系示蹤模型表明部分冠脈血管平滑肌細(xì)胞來(lái)源于Tbx18+心外膜祖細(xì)胞。心外膜的