應用GSTpull-down篩查HSF4b相互作用蛋白.pdf

1、白內障是最重要的人類眼科疾病，是人類失明的最主要原因。熱休克蛋白4（HSF4）屬于熱休克轉錄因子(HSFs)家族，該家族成員可在熱或其它應激情況時，激活熱休克反應基因，調控細胞正常的生長和發(fā)育過程。HSF4基因是一個白內障致病基因，其突變可引起先天性白內障和年齡相關性白內障。HSF4有兩種可變剪接本，編碼不同的亞型HSF4a和HSF4b，這兩種剪接轉錄本可能具有不同的功能，其中HSF4b在晶狀體中高度表達，被認為與白內障發(fā)生高度相關。盡

2、管幾個不同的研究小組制備了knock-out小鼠，但目前對HSF4突變引起白內障的分子機制仍不清楚。
　　 發(fā)現(xiàn)HSF4基因的相互作用蛋白，對于揭示HSF4突變導致白內障形成的分子機理具有重要意義。我們實驗室克隆了HSF4的cDNA全長序列，并構建了晶狀體細胞cDNA文庫。應用酵母雙雜交篩選，我們得到一些與HSF4b可能存在相互作用的蛋白，其中包括鋅指轉錄因子143（ZNF143），藍白斑實驗表明這兩個基因存在相互作用。

3、　　 本研究中，我們首先選用GST pull-down試驗，來驗證是否HSF4b與ZNF143存在相互作用。我們構建了能表達GST-HSF4b融合蛋白的原核表達載體質粒，將其轉化BL21 菌株中進行表達，通過谷胱甘肽瓊脂糖珠與GST的高免疫親和性進行GST-HSF4b融合蛋白的純化，并通過GST pull-down分析來驗證HSF4b與ZNF143的相互作用，在本研究中并未檢測到HSF4b與ZNF143蛋白之間的相互作用。
　　

4、 本研究中，我們還嘗試直接通過GST pull-down結合SDS-PAGE銀染色分析的方法，來尋找可能與HSF4b存在相互作用的未知蛋白，對晶狀體上皮細胞裂解液中拉下的蛋白進行SDS-PAGE電泳及通過銀染色，我們得到了兩條候選蛋白條帶。
　　 我們應用GST pull-down方法，對酵母雙雜交得到的HSF4b相互作用蛋白進行了驗證，并應用該法來直接尋找與HSF4b相互作用的未知蛋白。我們的研究為HSF4b的功能研究提供了