白內(nèi)障致病基因HSF4與SNF8相互作用的鑒定.pdf

1、先天性白內(nèi)障是兒童致盲的主要原因之一,發(fā)病率大約為0.3-1.5/1000,近一半的先天性白內(nèi)障是與遺傳相關(guān)的,已經(jīng)確定的可導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的有26個(gè)致病基因,以及大約40個(gè)可能的基因位點(diǎn)。在調(diào)控晶狀體早起發(fā)育中,熱休克轉(zhuǎn)錄因子4(HSF4)作為轉(zhuǎn)錄因子起到關(guān)鍵作用,位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致先天性白內(nèi)障。HSF4有HSF4a和HSF4b兩種亞型。HSF4b缺失可下調(diào)鼠晶狀體中熱休克蛋白的表達(dá),同時(shí)還會(huì)上調(diào)FGF家族成員的表達(dá)

2、。然而,HSF4轉(zhuǎn)錄活性的具體分子機(jī)制尚不清楚,研究與HSF4相互作用的蛋白質(zhì)對(duì)于建立HSF4相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò),以及這一轉(zhuǎn)錄因子是如何在晶狀體發(fā)育中發(fā)揮作用的具有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期工作中,通過(guò)酵母雙雜交的方法發(fā)現(xiàn)可能與HSF4存在相互作用的蛋白質(zhì)——SNF8。本文主要利用GSTpull-down技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)這兩種方法對(duì)酵母雙雜交結(jié)果——HSF4與SNF8之間存在相互作用進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　本實(shí)驗(yàn)中首

3、先通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)SNF8在小鼠晶狀體中表達(dá),蛋白印跡分析發(fā)現(xiàn)其在人的晶狀體上皮(HLE)細(xì)胞中表達(dá)。從HLE細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆得到SNF8基因全長(zhǎng),并將其編碼序列插入真核表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-7.1中,測(cè)序后轉(zhuǎn)染HLE細(xì)胞進(jìn)行表達(dá);同時(shí)將重組的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-hsf4b轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌中,通過(guò)IPTG誘導(dǎo),經(jīng)過(guò)谷胱甘肽TM4B瓊脂糖珠純化后與含有上述外源表達(dá)SNF8蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液進(jìn)行孵育,最后通

4、過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)HSF4b與SNF8之間存在相互作用。
　　基于GSTpull-down的結(jié)果,我們用免疫共沉淀的方法對(duì)HSF4b與SNF8之間的互作關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證分析。將真核表達(dá)質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-7.1-SNF8和pEGFP-Hsf4b-wt共同轉(zhuǎn)入HLE細(xì)胞,48小時(shí)后裂解細(xì)胞,向裂解液中加入抗標(biāo)簽蛋白的抗體進(jìn)行孵育,再與ProteinA/G瓊脂糖珠子孵育一段時(shí)間,洗滌洗脫后經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分