剛地弓形蟲培養(yǎng)上清對卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的影響.pdf

1、目的：卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤,及早發(fā)現(xiàn)可以有效提高病人生存率,但由于發(fā)病隱匿,無明顯癥狀,往往病情會被忽視,因此,卵巢癌又稱為“沉默殺手”。據(jù)統(tǒng)計,在100000個婦女中,就有3.8位死于此病。雖然近20年來在卵巢癌治療方面取得了長足進(jìn)展,但均未能顯著改善患者的長期生存率。因此,針對能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長的新抗癌藥的不斷開發(fā)應(yīng)用,是十分迫切的任務(wù)。目前抑制腫瘤細(xì)胞的生長主要通過兩個方面：一方面可以通過改變細(xì)胞的周期,使其不能進(jìn)

2、行正常的有絲分裂,另外一方面可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡,通過改變凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平來增加了腫瘤細(xì)胞凋亡率,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和集落形成能力,提高腫瘤細(xì)胞化療藥物和放療的敏感性。弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲,其寄生于宿主細(xì)胞過程中,蟲體與細(xì)胞的生物學(xué)特性均會發(fā)生改變，研究二者間的聯(lián)系,一直是國內(nèi)外關(guān)注的焦點。業(yè)已證實的是弓形蟲在寄生過程中可以抑制宿主細(xì)胞增值,引起細(xì)胞周期改變,并且誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。本文利用液氮保種小鼠傳代及CF-11纖維

3、素純化的方法提取制作弓形蟲培養(yǎng)上清液,將其視為一種生物制劑在體外條件下人卵巢癌細(xì)胞SKOV-S細(xì)胞共培養(yǎng),來觀察弓形蟲培養(yǎng)上清液對SKOV-S細(xì)胞生物學(xué)行為影響。
　　 方法：⑴采用四甲基氮噻唑藍(lán)(MTT)法檢測空白對照組與剛地弓形蟲培養(yǎng)上清處理組的吸光度(A490值)并按公式計算卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞增殖抑制率。⑵PI染色后,上流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測空白對照組與剛地弓形蟲培養(yǎng)上清處理組的細(xì)胞周期。⑶Annexin-v-FITC

4、/PI染色后,上流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測空白對照組與剛地弓形蟲培養(yǎng)上清處理組的細(xì)胞凋亡率。⑷熒光顯微鏡觀察空白對照組與剛地弓形蟲培養(yǎng)上清處理組的細(xì)胞在不同時項形態(tài)改變情況。⑸采用瓊脂糖凝膠電泳觀察培養(yǎng)上清處理組的凋亡DNA條帶。⑹采用western blot,對培養(yǎng)上清處理前后,卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞周期蛋白cyclinB1、cdc2及凋亡蛋白bcl-2及bax表達(dá)量進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果：①MTT法檢測結(jié)果顯示卵巢癌細(xì)胞SKOV

5、-3細(xì)胞增殖抑制率隨著剛地弓形蟲速殖子培養(yǎng)上清濃度和作用時間增加均明顯增大,弓形蟲速殖子培養(yǎng)試驗組抑制率與對照組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。②培養(yǎng)上清作用于卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞48h后,對照組與3×107、6×107、12×107/mL數(shù)量的弓形蟲速殖子培養(yǎng)上清組的卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例分別為(22.43±3.78)％、(35.56±5.22)％、(38.76±3.19)％、(44.95±4.

6、74)％,以12×107/mL數(shù)量組增加最為明顯,差異具有顯著性意義(n=5,p<0.05),提示培養(yǎng)上清具有誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞G2/M期停滯的作用,且有一定劑量依賴性。③以濃度為12×107/mL弓形蟲速殖子培養(yǎng)上清作用后24、36、48、72h后的卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞用Annexin-v-FITC與PI雙染后,FCM分析細(xì)胞凋亡,結(jié)果表明其凋亡率分別為15.23％、16.12％、18.23％、17.64％,與空白對

7、照組0.64％、0.83％、1.56％、2.67％比較有顯著差異(p<0.05)。④選擇與數(shù)量為12×107/ml弓形蟲速殖子培養(yǎng)上清作用不同時間段的細(xì)胞置熒光顯微鏡下觀察,可見2種細(xì)胞形態(tài):早期凋亡細(xì)胞,細(xì)胞膜著綠色,核拒染；凋亡中晚期細(xì)胞與壞死細(xì)胞,核著紅色,細(xì)胞膜著綠色,空白對照組的正常細(xì)胞不著色。⑤以濃度為12×107/ml弓形蟲速殖子培養(yǎng)上清作用細(xì)胞不同時間后的瓊脂糖凝膠電泳均出現(xiàn)了相差約180-200bp的典型的細(xì)胞凋亡的D

8、NA梯形條帶。⑥弓形蟲速殖子培養(yǎng)上清作用前卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞可見周期蛋白cyclinB1、cdc2與凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)的表達(dá)。上清作用48h后,與對照組相比,不同處理組的cyclinB1表達(dá)量(表達(dá)積分光密度值,下同)為0.86±0.04、0.73±0.06、0.60±0.05；cdc2蛋白表達(dá)量為0.98±0.02,0.84±0.05、0.65±0.06；cyclinB1蛋白表達(dá)量為0.97±0.05,0.81±

9、0.02和0.78±0.05；cdc2蛋白表達(dá)量為1.23±0.03,1.54±0.04、1.75±0.02,與對照組相比均有顯著性差異(p<0.05),以12×107/mL數(shù)量的弓形蟲速殖子組最為明顯(p<0.05)。
　　 結(jié)論：弓形蟲速殖子培養(yǎng)上清對體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,其途徑可能與調(diào)節(jié)周期蛋白cyclinB1、cdc2等蛋白表達(dá)或活性改變引起細(xì)胞株G2/M期阻滯有關(guān)；同時,弓形蟲速殖子培