喉癌細(xì)胞系腫瘤側(cè)群細(xì)胞的研究.pdf

1、第一部分人喉癌細(xì)胞系Hep-2和AMC-HN-8中側(cè)群細(xì)胞的檢測和分選
　　目的：探討人喉癌細(xì)胞系中是否存在腫瘤側(cè)群細(xì)胞及建立可靠的喉癌細(xì)胞系側(cè)群細(xì)胞(SP細(xì)胞)檢測及分選的操作規(guī)程。
　　方法：以人喉癌細(xì)胞系Hep-2和AMC-HN-8為研究對(duì)象,5μg/mLHoechst33342,150μmol/L維拉帕米,1μg/mL碘化丙啶,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞系中SP細(xì)胞的比例并對(duì)Hep-2中SP細(xì)胞進(jìn)行分選并檢測其純度。以

2、含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)SP及non-SP細(xì)胞及細(xì)胞爬片,觀察細(xì)胞活性及培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)。
　　結(jié)果：Hep-2細(xì)胞SP比例為17.1±2.0％,AMC-HN=-中sP的比例為11.8±1.7％。經(jīng)維拉帕米處理后比例分別降為0％及0.3±0.1％。流式細(xì)胞術(shù)分選Hep-2細(xì)胞SP的純度可達(dá)99.2±0.2％,non-SP細(xì)胞的純度達(dá)98.5±0.5％;在含血清培養(yǎng)基中SP及non-SP細(xì)胞均貼壁生長,死細(xì)胞少,爬片檢查提示均為典型的鱗癌細(xì)胞

3、表現(xiàn)。結(jié)論喉癌細(xì)胞系中存在SP細(xì)胞,能被維拉帕米所抑制,流式細(xì)胞技術(shù)可有效的分選SP細(xì)胞。
　　第二部分人喉癌Hep-2細(xì)胞系中腫瘤側(cè)群細(xì)胞生物學(xué)特性
　　目的：通過與non-SP相比較,研究喉癌Hep-2細(xì)胞系腫瘤SP細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　方法：分選的1×104SP細(xì)胞及non-SP細(xì)胞以0.2ml無血清培養(yǎng)基種植于同一96孔板上,在1、3、5、7d觀察生長狀態(tài)并用CCK-8法測定細(xì)胞的增殖狀態(tài),繪制細(xì)胞生長曲線,

4、比較兩組細(xì)胞的增殖速度;分選后細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的0、4、8、12d用流式細(xì)胞儀動(dòng)態(tài)測試SP細(xì)胞在培養(yǎng)體系中的百分比,以評(píng)估其分化能力;分選的1×104SP細(xì)胞及non-SP細(xì)胞種植于同一96孔板上,培養(yǎng)1天后以2Gy的劑量射線照射,2d后用CCK-8法測定細(xì)胞的增殖狀態(tài),計(jì)算射線對(duì)細(xì)胞的抑制率,比較兩組細(xì)胞對(duì)放射線的耐受性;將1×105,5×104及2×104的SP及non-SP細(xì)胞分別注射于8只NOD/SCID鼠的腋窩皮下,8

5、周后觀察成瘤情況,比較兩組細(xì)胞的致瘤性。
　　結(jié)果：在無血清環(huán)境下SP細(xì)胞及non-SP呈不貼壁、球形、半透明狀,培養(yǎng)后SP細(xì)胞漸成簇生長,而non-SP細(xì)胞不能形成細(xì)胞球;在第1、3、5、7d時(shí)SP細(xì)胞的吸光度分別為0.665±0.017,1.086±0.069,1.387±1.107,1.675±0.07,而non-SP細(xì)胞為0.694±0.0530.951±0.0311.049±0.092,1.008±0.086,除第1d外

6、均具有顯著性差異;分選后SP細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的4、8、12dB寸SP的比例為47.8±1.1％,27.8±3.6％和17.3±1.9％,而non-SP培養(yǎng)后為2.2±0.1％,4.7±0.4％和4.9±0.3％:經(jīng)射線照射后SP細(xì)胞與non-SP細(xì)胞的抑制率分別為6.7±3.5％和29.9±4.9％(t=14.295,p=.000);細(xì)胞數(shù)為5×104,SP與non-SP的成瘤數(shù)分別為7和2(p=0.41),細(xì)胞數(shù)為2×104時(shí)

7、成瘤數(shù)SP細(xì)胞成瘤數(shù)為6,而non-SP不能成瘤(p=0.007)。
　　結(jié)論：Hep-2細(xì)胞系中的SP細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖、分化、成瘤能力,對(duì)射線具有耐受性,證明該SP細(xì)胞具有干細(xì)胞的相關(guān)特性,它富含腫瘤起始細(xì)胞。但同時(shí)也說明SP細(xì)胞也是不均質(zhì)的,我們不能將SP細(xì)胞認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞。
　　第三部分人喉癌Hep-2細(xì)胞系腫瘤側(cè)群細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)分析
　　目的：探討干細(xì)胞相關(guān)基因CD133、ABCG2、Bmi1、

8、Notch2及PTEN在SP細(xì)胞中的表達(dá)。
　　方法：以RealtimePCR檢測SP細(xì)胞與non-SP細(xì)胞CDl33、ABCG2、Bmi1、Notch2及PTEN在SP細(xì)胞中的表達(dá)的差異。
　　結(jié)果：CD133、ABCG2、Bmi1及NOTCH2在SP細(xì)胞中高表達(dá),而PTEN在SP細(xì)胞與non-SP細(xì)胞中表達(dá)無明顯差異
　　結(jié)論：干細(xì)胞相關(guān)基因在SP細(xì)胞的形成及維持中可能起重要作用,ABCG2在SP細(xì)胞的形成中起重要