靜壓力作用下經典Wnt信號通路調控牙周膜干細胞骨向分化的機制研究.pdf

1、正畸牙移動（orthodontic tooth movement，OTM）涉及了復雜的生物學行為，主要包括兩個層面的內容：生物力學和生物學，前者是指機械刺激作用于牙齒，產生張應力和壓應力，而后者是指牙齒感受應力，并將其傳遞至牙周組織，從而引發(fā)了一系列復雜的細胞生物學反應，二者相互關聯(lián)，協(xié)同作用。有研究證實，在OTM過程中，張力側成骨活躍，主要表現為以骨沉積為主的骨塑建；而壓力側成骨/破骨動態(tài)平衡，以骨吸收為主。了解更多更新的OTM發(fā)生發(fā)

2、展的生物學基礎，將有助于我們更加安全有效的開展臨床工作。
　　眾所周知，在OTM過程中，牙周組織感受機械應力，并產生生物學效應，是保證牙齒移動的關鍵因素。牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）存在于牙周組織，可自我更新，并分化為成骨細胞等成熟細胞。有文獻報道稱，PDLSCs參與維持牙周膜內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，在牙槽骨改建中發(fā)揮了一定的作用，推測其在OTM過程中扮演了重要的角色。隨后，有

3、學者利用大鼠OTM模型證實，隨著加力時間的延長，不僅張力側牙周膜內PDLSCs的數目逐漸增多，而且壓力側PDLSCs亦呈上升趨勢，提示其參與了OTM。而體外細胞力學加載實驗雖已發(fā)現，在牽張力等機械刺激的作用下，PDLSCs的增殖和分化等生物學特性會發(fā)生明顯改變，但關于壓應力對其生物學行為影響的研究很少且機制不清。但目前已有研究證實，Wnt信號通路廣泛存在于生物體內，參與調節(jié)骨源性細胞對機械刺激的適應性反應，在骨的形成和改建中發(fā)揮了重要的

4、作用。
　　因此本課題首先建立大鼠OTM模型，通過檢測PDLSCs在大鼠牙周膜內的表達，為其參與OTM提供了新的證詞；隨后使用可控液壓加載裝置，模擬體內 PDLSCs的受壓環(huán)境，通過檢測體外培養(yǎng)的 PDLSCs受壓后成骨分化相關指標的表達變化，探討OTM過程中壓力對PDLSCs骨向分化能力的影響；最后，本實驗還通過檢測壓力作用下經典Wnt信號通路對PDLSCs骨向分化能力的調控，為OTM過程中細胞生物學反應及其發(fā)生機制提供了理論和

5、實驗基礎。
　　第一部分大鼠OTM模型的研究
　　目的:
　　構建大鼠OTM模型，檢測PDLSCs在大鼠牙周膜內的表達，證實PDLSCs參與了OTM。
　　方法:
　　按隨機原則，將大鼠分為4組，包括對照組和實驗1、3、7d組，每組6只，其中空白對照組不施加任何壓力裝置，而正畸加力組則以上頜切牙為支抗，用螺旋鎳鈦拉簧拉大鼠右上頜第一磨牙近移。加力完成后取材，HE染色觀察牙周組織形態(tài)學變化。TRAP染色檢測壓

6、力側牙周膜內破骨細胞的數目變化。免疫組化染色觀察干細胞標記nestin和PDGFRα的表達。
　　結果:
　?。?）HE染色結果顯示，牙周組織形態(tài)學變化具有時間依賴性，表現為與對照組相比，隨著加力時間的增長，壓力側牙周膜間隙逐漸縮小，牙槽骨吸收越來越嚴重。
　?。?）TRAP染色結果顯示，大鼠壓力側牙周膜內靠近牙槽骨吸收凹陷處可見破骨細胞。
　?。?）免疫組化染色結果顯示，與對照組相比，隨著加力時間的延長，大鼠壓

7、力側牙周膜內nestin與PDGFRα的表達呈上升趨勢。
　　結論
　　PDLSCs在大鼠牙周膜內的數目增多及分布更廣，表明其參與了OTM。
　　第二部分壓力對hPDLSCs成骨分化能力的影響
　　目的:
　　使用可控液壓加載裝置，模擬體內hPDLSCs的受壓環(huán)境，檢測受壓后hPDLSCs的成骨相關指標的表達變化，探討壓力對hPDLSCs骨向分化能力的影響。
　　方法:
　?。?）體外分離培養(yǎng)h

8、PDLSCs，對其干性和分化能力進行鑒定
　?。?）使用壓應力加載裝置，對體外培養(yǎng)的hPDLSCs施加100KPa的靜壓力，分別于加壓處理1h和12h后，收集樣品，檢測hPDLSCs成骨分化能力的改變。
　　結果:
　　（1）使用有限稀釋法分離培養(yǎng)的hPDLSCs，克隆形成率為28％。干性鑒定結果顯示，干細胞標記物CD105、CD29、CD44和stro-1表達呈陽性，而CD34和CD45的表達呈陰性。ALP染色、茜素

9、紅染色、Western blot和RT-PCR結果顯示，誘導后其成骨分化能力增強；油紅染色、Western blot和RT-PCR結果顯示，誘導后其成脂分化能力增強。
　?。?）當100KPa的靜壓力作用1h時，ALP染色及其活性檢測結果顯示，hPDLSCs成骨分化能力增強；Western blot和RT-PCR結果顯示，hPDLSCs表達ALP和RUNX2明顯升高。而當壓力持續(xù)至12h時，ALP染色及其活性檢測結果顯示，hPDL

10、SCs成骨分化能力降低；Western blot和RT-PCR結果顯示，ALP和RUNX2表達量下調。
　　結論:
　?。?）通過有限稀釋法分離培養(yǎng)的hPDLSCs具有干細胞特性。
　?。?）適宜的靜壓力在短時間內上調了hPDLSCs的成骨能力，而長時間內則對其起抑制作用。
　　第三部分經典Wnt信號通路對PDLSCs成骨分化能力的影響
　　目的:
　　通過檢測壓力作用下經典 Wnt信號通路相關指標的

11、表達變化以及調節(jié)通路后hPDLSCs成骨分化能力的改變，明確經典Wnt信號通路對hPDLSCs成骨分化能力的影響。
　　方法:
　?。?）組織切片免疫組化染色，觀察大鼠壓力側牙周膜內經典Wnt信號通路效應分子active-β-catenin的表達變化。
　　（2）Western blot和RT-PCR檢測100KPa/1h和100KPa/12h的靜壓力作用下經典Wnt信號通路相關指標的表達變化。
　?。?）在10

12、0KPa/1h和100KPa/12h的壓力條件下，分別使用wnt3a和DKK1調節(jié)經典 Wnt信號通路后，ALP染色及其活性檢測觀察 hPDLSCs成骨分化能力的改變，Western blot和RT-PCR檢測hPDLSCs表達ALP和RUNX2的變化。
　　結果:
　?。?）免疫組化結果顯示，隨著加力時間的延長，大鼠壓力側牙周膜中active-β-catenin的表達呈上升趨勢。
　?。?）Western blot結

13、果顯示，當100KPa的靜壓力作用1h后，hPDLSCs表達P-GSK-3β、active-β-catenin和β-catenin下降，而GSK-3β的表達量上升；當壓力持續(xù)到12h時，檢測結果與上述相反。RT-PCR結果無統(tǒng)計學意義。
　?。?）靜壓力作用下，上調經典Wnt信號通路后，ALP染色及其活性檢測結果顯示，hPDLSCs的成骨能力被抑制；Western blot和RT-PCR結果顯示，ALP和RUNX2的表達下降。而抑