賴型鉤端螺旋體毒力基因mviN的克隆表達(dá)及功能研究.pdf

1、鉤端螺旋體(Leptospira)是系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化上結(jié)構(gòu)和遺傳特征都較特殊的一類微生物，它所導(dǎo)致的鉤端螺旋體病是在世界范圍內(nèi)流行的人獸共患自然疫源性疾病。問號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴型56601株全基因組測(cè)序于2003年由中國科學(xué)家完成，對(duì)鉤端螺旋體的研究重點(diǎn)將轉(zhuǎn)向功能蛋白組學(xué)研究。鉤端螺旋體與宿主相互作用是鉤端螺旋體致病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，研究與鉤端螺旋體粘附侵襲相關(guān)的毒力因子的功能，對(duì)闡明鉤端螺旋體致病機(jī)制和免疫機(jī)理具有重要意義。

2、 通過全基因組生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，mviN基因是個(gè)粘附侵襲毒力基因，存在于許多致病微生物中。鉤端螺旋體mviN基因讀碼框含有1596個(gè)核苷酸序列，編碼531個(gè)氨基酸，表達(dá)產(chǎn)物是一跨膜蛋白。 本研究以問號(hào)鉤端螺旋體黃疸出血群賴型017株基因組為實(shí)驗(yàn)材料，PCR擴(kuò)增出含完整讀碼框的mviN基因，與原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-mviN，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。以全菌體總蛋白作SDS-P

3、AGE，并以兔抗全鉤端螺旋體多價(jià)血清為一抗，以HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗作Western-blot分析。結(jié)果顯示成功表達(dá)了分子量約為80kD的MviN融合蛋白。MviN融合蛋白在菌體內(nèi)主要以可溶性方式表達(dá)，經(jīng)親和層析純化，獲得了高純度的MviN融合蛋白。 進(jìn)一步構(gòu)建了mviN基因與pcDNA3.1(+)的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-mviN；利用脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1-mviN轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，并以RT-PCR法檢測(cè)