SIRT3介導(dǎo)的呼吸鏈復(fù)合體質(zhì)量控制機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　乙?；揎棡榧?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種，可逆的乙?；揎椷^程可通過改變基因表達(dá)水平，蛋白酶活性以及蛋白蛋白相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的各類活動(dòng)。在線粒體內(nèi)總計(jì)1000-1500個(gè)蛋白中，大約有200多個(gè)蛋白存在乙酰化修飾作用，其中多數(shù)蛋白的乙酰化修飾由NAD+依賴的去乙?；窼IRT3完成。SIRT3主要位于線粒體基質(zhì)，線粒體內(nèi)有100多個(gè)蛋白的去乙?；cSIRT3相關(guān)。SIRT3表達(dá)的變化與線粒體內(nèi)ATP的生成，ROS水

2、平，蛋白的氧化損傷，以及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ與Ⅱ的活性密切相關(guān)。SIRT3的異常低表達(dá)或缺失能夠?qū)е掳ò┌Y，衰老以及衰老相關(guān)的退行性疾病的發(fā)生。研究已經(jīng)明確，SIRT3缺失或低表達(dá)能夠顯著提升細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和蛋白質(zhì)氧化損傷。而細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的提高和蛋白質(zhì)氧化損傷的加劇同樣也是線粒體蛋白質(zhì)量控制低下的主要指標(biāo)，并且與SIRT3異常相關(guān)的各類疾病同樣也發(fā)生于線粒體蛋白質(zhì)量控制缺陷的細(xì)胞中。雖然SIRT3相關(guān)的線粒體蛋白質(zhì)量控制的研究在過

3、去的2-3年內(nèi)已逐漸開展，而針對呼吸鏈復(fù)合體水平的蛋白質(zhì)量控制研究未見有任何報(bào)道。由于線粒體內(nèi)行使氧化磷酸化的蛋白均為復(fù)合體形式存在，直接對復(fù)合體水平而不是亞基水平的蛋白質(zhì)量控制機(jī)制進(jìn)行研究將更有利于疾病發(fā)生機(jī)制的闡述。
　　研究目的:
　　1.明確SIRT3對線粒體功能的調(diào)控作用，其中包括線粒體ATP的生成，ROS生成，呼吸鏈復(fù)合體的酶活性;
　　2.通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)分析SIRT3與線粒體蛋白質(zhì)量控制的關(guān)系;

4、>　　3.明確SIRT3通過何種途徑干預(yù)線粒體蛋白的質(zhì)量控制，為SIRT3相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.利用分子生物學(xué)手段建立SIRT3高表達(dá)細(xì)胞模型以及Sirt3基因敲除動(dòng)物模型來研究SIRT3對線粒體生物學(xué)功能的改變作用;
　　2.利用非變性凝膠/免疫印跡技術(shù)以及呼吸鏈酶活性分析技術(shù)分析SIRT3與線粒體呼吸鏈復(fù)合體蛋白質(zhì)量的關(guān)系;
　　3.通過同位素示蹤以及免疫印跡技術(shù)研究S

5、IRT3對線粒體復(fù)合體質(zhì)量的影響;
　　4.利用免疫共沉淀技術(shù)尋找能夠調(diào)控線粒體復(fù)合體質(zhì)量且被SIRT3乙?；揎椀姆肿影閭H蛋白或蛋白酶;
　　5.利用免疫共沉淀/質(zhì)譜分析技術(shù)以及同位素免疫共沉淀技術(shù)研究分子伴侶調(diào)控線粒體復(fù)合體質(zhì)量控制的機(jī)制;
　　6.利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)SIRT3是否通過對特定靶蛋白的去乙?；揎椪{(diào)控呼吸鏈復(fù)合體的質(zhì)量。
　　研究結(jié)果:
　　1.不管是長鏈SIRT3還是短鏈SIR

6、T3均能影響線粒體功能，結(jié)合以前的研究，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3能夠通過其乙酰化作用影響呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ的功能，復(fù)合體功能的改變也直接導(dǎo)致了線粒體ATP生成水平的改變。
　　2.SIRT3高表達(dá)能降低線粒體呼吸鏈復(fù)合體的含量，相應(yīng)的Sirt3基因敲除能夠提升復(fù)合體的含量，我們推測SIRT3可能通過影響復(fù)合體的組裝達(dá)到對呼吸鏈復(fù)合體含量的負(fù)調(diào)控作用，這種負(fù)調(diào)控作用在一定程度上增加了單位量復(fù)合體的酶活性。表明SIRT3與線粒體

7、呼吸鏈復(fù)合體的質(zhì)量控制存在相關(guān)性。
　　3.SIRT3通過加快呼吸鏈復(fù)合體的更新速度（組裝與去組裝）來完成其對呼吸鏈復(fù)復(fù)合體的負(fù)調(diào)控作用。
　　4.作為蛋白質(zhì)量控制重要組成的GRP75功能受SIRT3調(diào)控，而SIRT3對呼吸鏈復(fù)合體質(zhì)量控制的調(diào)控作用可能經(jīng)由GRP75得以完成。
　　5.SIRT3介導(dǎo)的呼吸鏈復(fù)合體快速更新取決于較高水平的GRP75與呼吸鏈復(fù)合體的相互作用。GRP75的低表達(dá)能夠通過下調(diào)呼吸鏈復(fù)合體蛋白

8、的降解與組裝速度降低SIRT3過表達(dá)細(xì)胞中呼吸鏈復(fù)合體的更新速率。
　　6.GRP75是SIRT3介導(dǎo)的呼吸鏈復(fù)合體質(zhì)量控制的主要調(diào)控因子，高質(zhì)量的呼吸鏈復(fù)合體將進(jìn)一步降低線粒體內(nèi)ROS的生成，從而維持更高質(zhì)量的呼吸鏈復(fù)合體蛋白。
　　結(jié)論:
　　SIRT3對GRP75蛋白的去乙?；揎椬饔媚軌蛟黾泳€粒體呼吸鏈復(fù)合體蛋白的更新，而這種快速更新可以通過對錯(cuò)誤組裝以及損傷的呼吸鏈復(fù)合體高效清除能力來提高呼吸鏈復(fù)合體的質(zhì)量。