虎杖苷通過激活SIRT3介導的線粒體保護減輕失血性休克小腸損傷.pdf

1、目的:
　　通過小腸上皮細胞IEC-6的氧化應激模型和大鼠的失血性休克模型探討SIRT3和線粒體在失血性休克小腸損傷中的作用，為PD在失血性休克病人的臨床應用提供新的理論依據(jù)。
　　方弦:
　　1.模型與分組
　　1.1 細胞氧化應激損傷模型的確立及分組
　　H2O2的最適刺激條件:96孔板中培養(yǎng)融合度約90％的IEC-6細胞經(jīng)不同濃度(0、25、50、100、250、500uM/L) H2O2溶液刺激不同

2、時間(0、15、30、60、120min)，用CCK8細胞增殖-毒性檢測試劑盒檢測不同條件刺激組細胞的活性。以刺激后細胞活性下降20-30％為理想標準，獨立重復實驗三次以確定氧化應激模型的最適H2O2刺激濃度和時間。
　　PD的最佳保護濃度:細胞經(jīng)過不同濃度(0、25、50、100uM/L)的PD處理12小時，用CCK8試劑盒檢測不同濃度PD處理組細胞的活性，獨立重復實驗三次以確定PD的最佳保護濃度。
　　細胞不同處理分組:

3、將生長良好的IEC-6細胞隨機分為5組(n=6)。(1)空白對照組;(2)溶劑預處理組;(3) PD預處理組;(4) PD+3-TYP（SIRT3選擇性抑制劑，50uM/L)預處理組;(5) RSV預處理組(RSV25uM/L)。預處理12小時后，最適條件的H2O2刺激，一定時間收集不同處理組的細胞做后續(xù)指標的檢測。
　　1.2 大鼠失血性休克模型的建立及分組
　　實驗符合國際和中國的實驗動物管理辦法，并由南方醫(yī)科大學動物飼

4、養(yǎng)使用委員會批準。大鼠的休克模型參照本實驗室既往的實驗方案進行，即通過股動脈放血至30mmHg，維持2小時后回輸血，繼續(xù)觀察2小時。實驗動物隨機分為五組(n=14):假手術對照組（control組）、溶劑組(vehicle組)、虎杖苷治療組(PD組)，虎杖苷+抑制劑組（PD+3-TYP組）、白藜蘆醇治療組(RSV組)。每組6只大鼠用斷頸法處死以組織提取和線粒體形態(tài)觀察，8只撤去導管，縫合傷口做生存分析。
　　2.檢測指標
　

5、　2.1 虎杖苷對氧化應激損傷小腸上皮細胞線粒體的影響
　　通過檢測線粒體跨膜電位（△Ψm）、線粒體通透轉變孔(MitochondrialPermeability TransitionPore，mPTP)開放和細胞內ATP含量來評價氧化應激對線粒體結構和功能影響，以及虎杖苷干預治療的影響?！鳓穖越低，mPTP開放越多，細胞ATP含量越低，說明線粒體損傷越嚴重。
　　2.2 虎杖苷對氧化應激損傷小腸上皮細胞內氧化應激水平的影響

6、
　　通過流式技術檢測DCF熒光評價不同處理組細胞ROS水平，熒光越強，ROS水平越高，說明氧化應激損傷越嚴重。
　　2.3 虎杖苷對失血性休克大鼠的小腸上皮細胞線粒體結構的影響
　　收集失血性休克大鼠的小腸組織，制作成超薄組織切片，在透射電子顯微鏡下觀察細胞線粒體的形態(tài)。正常細胞線粒體呈橢圓形，線粒體基質致密，嵴完整、排列整齊且結構正常，而損傷線粒體呈不規(guī)則形，腫脹明顯，嵴排列紊亂或斷裂，輪廓不清，線粒體基質透亮，呈

7、空泡狀。通過比較線粒體損傷程度評價虎杖苷對失血性休克腸損傷的干預作用。
　　2.4 虎杖苷對失血性休克大鼠小腸組織氧化應激水平的影響
　　收集失血性休克大鼠的小腸組織勻漿，使用碧云天檢測試劑盒檢測各組的GSH/GSSG比例和丙二醛(MDA)含量來評價組織的氧化應激水平。GSH/GSSG比例越低，MDA含量越高，說明氧化應激水平越高。通過比較氧化應激水平來評價失血性休克的小腸損傷及虎杖苷的干預作用。
　　2.5 虎杖苷對

8、失血性休克大鼠小腸細胞凋亡和大鼠生存時間的影響
　　取失血性休克大鼠的小腸制成石蠟包埋的組織切片，使用Tunel細胞凋亡檢測試劑盒定位出凋亡的小腸細胞，然后在顯微鏡下記錄凋亡的細胞數(shù)目。凋亡細胞數(shù)越多，小腸損傷越嚴重。通過比較各組的凋亡細胞數(shù)，來評價失血性休克腸損傷和虎杖苷的干預作用。
　　失血性休克大鼠撤去導管，縫合傷口，給予足夠的飼料和水，觀察并記錄48h的生存時間。生存時間越短，說明失血性休克損傷越嚴重。通過比較不同治

9、療組的生存時間來評價失血性休克損傷和虎杖苷的干預作用。
　　2.6 虎杖苷的影響與組織、細胞內SIRT3的蛋白表達和活性的關系
　　Western blot技術檢測不同處理組SIRT3的蛋白表達水平;SIRT3活性檢測試劑盒檢測不同處理組SIRT3的酶活性。通過比較各組SIRT3的蛋白表達和酶活性來評估失血性休克對小腸SIRT3的影響及虎杖苷的干預作用。
　　2.7 虎杖苷的影響與組織細胞內SOD2的表達和活性的關系<

10、br>　　Western blot技術檢測不同處理組SOD2、acetyl-SOD2蛋白表達水平;SOD2活性檢測試劑盒檢測不同處理組SOD2活性。通過比較各組SOD2、acetyl-SOD2蛋白表達和SOD2活性來評估失血性休克對小腸中SOD2的影響及虎杖苷的干預作用。
　　結果:
　　1.細胞氧化應激模型模型的確立
　　以刺激后細胞活性下降20-30％為理想標準，H2O2250uM/L，30min被確立為最適刺激條

11、件，此時的細胞活性為正常對照74±2.2％。PD最佳保護濃度為50uM/L。
　　2.虎杖苷對氧化應激損傷小腸上皮細胞線粒體的影響
　　與正常對照組相比，H2O2刺激使小腸上皮細胞線粒體的結構和功能受損，線粒體跨膜電位(△Ψm)降低，線粒體通透轉變孔(mPTP)開放，細胞ATP含量降低?；⒄溶栈虬邹继J醇預處理可以減輕線粒體的氧化應激損傷，改善△Ψm降低、抑制mPTP開放、促進ATP合成，并且二者作用相當。使用SIRT3選擇性

12、抑制劑3-TYP可以部分抑制虎杖苷對氧化應激線粒體損傷的保護作用。
　　3.虎杖苷對氧化應激損傷小腸上皮細胞氧化應激水平的影響
　　與正常對照組相比，H2O2刺激使小腸上皮細胞的ROS急劇增加，氧化應激水平增高，虎杖苷或白藜蘆醇預處理可以降低ROS的產(chǎn)生，降低細胞的氧化應激水平，并且二者作用相當。使用3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷對氧化應激水平的影響。
　　4.虎杖苷對失血性休克大鼠的小腸細胞線粒體結構的影響

13、>　　與假手術對照組相比，失血性休克大鼠的小腸線粒體形態(tài)明顯受損，呈不規(guī)則形，腫脹明顯，嵴排列紊亂或斷裂，輪廓不清，線粒體基質透亮，呈空泡狀，虎杖苷或白藜蘆醇預處理可以減輕線粒體形態(tài)的改變，甚至接近正常線粒體形態(tài)。使用3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷這種線粒體保護作用。
　　5.虎杖苷對失血性休克大鼠小腸組織氧化應激水平的影響
　　與假手術對照組相比，失血性休克大鼠小腸組織的GSH/GSSG比率降低，MDA水平升高，失血性

14、休克造成細胞過度氧化?；⒄溶栈虬邹继J醇預處理可以改善GSH/GSSG比率降低和MDA水平升高，發(fā)揮抗氧化應激作用。3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷這種抗氧化應激作用。
　　6.虎杖苷對失血性休克大鼠小腸細胞凋亡和大鼠生存時間的影響
　　與假手術對照組相比，失血性休克大鼠小腸細胞凋亡增加，大鼠生存時間短。虎杖苷或白藜蘆醇預處理可以減少失血性休克導致的細胞凋亡，延長大鼠的生存時間。3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷的這種保護作

15、用。
　　7.虎杖苷的干預與組織、細胞內SIRT3的蛋白表達和活性的關系
　　與對照相比，模型組SIRT3的蛋白表達降低，酶活性下降，虎杖苷或白藜蘆醇預處理可以降低H2O2刺激和失血性休克SIRT3的影響，使蛋白表達輕微升高，酶活性極大升高。3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷對SIRT3的影響，但未抑制SIRT1的活性和表達。
　　8.虎杖苷的干預與組織、細胞內SOD2的表達和活性的關系
　　與對照相比，模型組S

16、OD2表達降低，acetyl-SOD2表達增加，導致SOD2酶活性下降，虎杖苷或白藜蘆醇預處理可以降低H2O2刺激和失血性休克對SOD2的影響，使SOD2表達輕微增加，acetyl-SOD2表達極大降低，SOD2酶活性升高。3-TYP抑制劑可以部分抑制虎杖苷對SOD2的影響。
　　結論:
　　1.重癥失血性休克小腸細胞發(fā)生了線粒體損傷。
　　2.虎杖苷減輕重癥失血性休克小腸損傷，延長休克大鼠生存時間。
　　3.虎