人偏肺病毒結構蛋白N、F在三種不同系統(tǒng)中的表達.pdf

1、人偏肺病毒human metapneumovirus，簡稱hMPV，是荷蘭學者VandenHoogen等于2001年從患急性呼吸道感染的嬰幼兒臨床標本中首次分離鑒定出的一種新病毒，它與禽類肺病毒(APV)的C型有較高的同源性，已歸屬于副粘病毒科肺病毒亞科。其全基因組除了一部分終止序列未明外已克隆成功。hMPV基因組為負鏈RNA病毒，包括8個基因和9個開放閱讀框架。基因組編碼的主要結構蛋白有核蛋白(nucleoprotein，N)、基質(zhì)蛋

2、白(matrixprotein，M)、融合蛋白(fusionprotein，F(xiàn))、附著蛋白(attachmentglycoprotein，G)，其中F和G蛋白均為糖蛋白。另外還有磷蛋白P、22K蛋白M2和M2.2、小疏水蛋白SH、大多聚酶蛋白L。各蛋白基因組排列模式為3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’。目前的研究認為hMPV可能是一種常見的呼吸道感染病毒，在呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒陰性的呼吸道感染標本中其檢出率可

3、達10％，在上或下呼吸道甚至上下呼吸道中均有檢出，兒童和成人均有感染，尤其是早產(chǎn)兒、老人及有免疫缺陷的患者更易患hMPV感染。hMPV作為新發(fā)現(xiàn)的人類急性呼吸道感染的病毒已越來越受到人們的重視。
　　 當前hMPV的診斷只限于實驗研究，由于用作病毒培養(yǎng)的常用細胞系不支持hMPV的復制，hMPV生長緩慢、病變不典型且其在體外復制需要依賴胰酶，故采用通常的臨床病毒學方法很難鑒定hMPV?，F(xiàn)在主要依賴于RT-PCR檢測病毒的RNA對它

4、進行研究。要對hMPV進行深入研究并弄清它在我國各年齡組人群中的感染狀況急需病毒分離株或特異性抗原，但由于人類偏肺病毒不出現(xiàn)典型的細胞病變，在組織培養(yǎng)中分離十分困難，通過分子生物學手段獲得特異性抗原用于研究就成為可行之路。
　　 本研究組已經(jīng)獲得了北京地區(qū)hMPV基因序列，在試圖分離病毒株的同時，嘗試運用不同的表達系統(tǒng)(細菌，酵母，昆蟲)對人偏肺病毒重要的結構蛋白(N，F(xiàn))進行了表達。之所以選擇N和F蛋白，是因為N蛋白(nucl

5、eoprotein 1182bp，394aa)是核蛋白，氨基酸序列最保守，在不同的基因型別的病毒間差異最小。而F蛋白(fusionprotein，1620bp，539aa)是一個糖蛋白，文獻報道它是hMPV最主要的能引起中和保護性抗體的抗原。
　　 實施課題的第一階段:為了便于蛋白純化，在蛋白的N端加入了一個6His標簽和相應的酶切位點，構建了重組pBh1887N(K)質(zhì)粒(用于Bac-N-blu體系)和重組pFh1887N質(zhì)粒

6、(用于Bac-to-Bac體系)，測序均正確。雖然昆蟲Bac-N-blu體系中感染昆蟲細胞所收獲的上清進行藍蝕班篩選，出現(xiàn)了藍斑；昆蟲Bac-to-Bac體系中感染昆蟲細胞所收獲的上清進行PCR鑒定有目的基因的插入都說明桿狀病毒中有目的基因的插入，但是對感染72小時收獲的昆蟲細胞裂解液進行SDS-PAGE和Westernblot(分別用His抗體和hMPVN蛋白特異性抗體檢測)，在SDS-PAGE上未觀察到目的蛋白大小處有明顯的大量蛋白

7、表達，Westernblot也沒有檢測到目的蛋白。
　　 實施課題的第二階段:考慮是否該N端his標簽阻礙了蛋白的表達。嘗試變換標簽的位置到蛋白的C端，并嘗試在多體系中表達。構建了重組pB1887N質(zhì)粒(用于Bac-N-blu體系)，重組pF1887Nh質(zhì)粒(用于Bac-to-Bac體系)，單拷貝/雙拷貝的pAOα1887Nh重組質(zhì)粒(用于酵母表達系統(tǒng))，pET1887Nh重組質(zhì)粒(用于細菌表達系統(tǒng))，測序均正確。前兩個昆蟲表達

8、體系在收獲了感染72小時后的昆蟲細胞后，進行SDS-PAGE和Westernblot(分別用His抗體和hMPVN蛋白特異性抗體檢測)。在SDS-PAGE上未觀察到目的蛋白大小處有明顯的大量蛋白表達，Westernblot可以檢測到目的蛋白的表達。酵母表達系統(tǒng)無論單雙拷貝，培養(yǎng)基上清雖然在SDS-PAGE上可見到43Kd處有蛋白出現(xiàn)，且不同克窿、菌株相對于對照載體菌表達的量不一樣，但是進行Westernblot使用his抗體和特異性抗體

9、卻沒有檢測出目的蛋白。通過PCR可以鑒定到酵母基因組中已同源重組入目的基因。細菌表達系統(tǒng)有較好的表達并能通過Westernblot(分別用His抗體和hMPVN蛋白特異性抗體檢測)鑒定目的蛋白表達。
　　 實施課題的第三階段:在N蛋白嘗試表達的基礎上，構建了重組pB1816F質(zhì)粒(用于Bac-N-blu體)，重組pF1816Nh質(zhì)粒(用于Bac-to-Bac體系)，測序均正確。Bac-to-Bac體系所收獲的感染72小時后的昆蟲

10、細胞裂解液，進行SDS-PAGE和Westernblot(分別用His抗體和hMPVF蛋白特異性抗體檢測)。在SDS-PAGE上未觀察到目的蛋白大小處有明顯的大量蛋白表達，WesternblotHis抗體未檢測到目的蛋白，而F蛋白特異性抗體檢測在60kD可看到條帶出現(xiàn)。Bac-N-blu體系所收獲的感染72小時后的昆蟲細胞培養(yǎng)液得到藍蝕斑。
　　 實施課題的第四階段:選擇昆蟲體系陽性重組病毒(N蛋白)，擴大感染規(guī)模，his標簽純

11、化N蛋白，進行臨床血清學的調(diào)查鑒定，并同細菌表達的N蛋白測定結果進行比較，正在進行中。
　　 綜合以上結果說明:偏肺病毒蛋白在不同的表達系統(tǒng)中表達難易不同，N蛋白在細菌表達系統(tǒng)中最易表達，但F蛋白表達受阻，可能跟其具有一定毒性，結構復雜有關；酵母體系有可能對N蛋白有修飾作用，使其無法被特異的短肽抗體所識別，F(xiàn)蛋白在構建表達載體時即受阻，無法同前導肽相連；昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)對N，F(xiàn)蛋白均可以表達，但表達的量較低，有可能同初期重組病毒

12、滴度低有關，而且昆蟲細胞的狀態(tài)好壞對蛋白表達影響較大，優(yōu)化不易。在表達N蛋白時，構建了N端his標簽和C端his標簽的兩種重組質(zhì)粒，前者沒有表達而后者順利表達，測序結果均正確，無讀碼框的移位，提示his標簽對N蛋白表達產(chǎn)生了阻扼作用，通過結構分析考慮應是在轉(zhuǎn)錄的mRNA起始處產(chǎn)生復雜的二級結構，影響了翻譯的進行，需要在以后蛋白的表達中注意。
　　 通過研究各表達系統(tǒng)表達hMPV病毒蛋白，以期能夠找到一種理想的表達體系，所表達的病