重慶地區(qū)兒童人類偏肺病毒感染狀況調(diào)查及融合蛋白的真核表達(dá).pdf

1、PARTⅠ：重慶地區(qū)兒童偏肺病毒感染狀況調(diào)查 目的：檢測(cè)重慶地區(qū)兒童人類偏肺病毒(human metapneumovirus， hMPV)特異性IgG抗體，了解不同年齡兒童該病毒感染狀況。 方法：由于hMPV與兒童最常見的呼吸道病毒病原——呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus，RSV)同屬副粘病毒科，需首先明確hMPV與RSV有否交叉抗原。采用RSV抗原吸附血清標(biāo)本中可能存在的RSV抗

2、體，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)法比較未經(jīng)吸附和已吸附 RSV 抗體的血清與 RSV 或 hMPV 感染細(xì)胞裂解液的反應(yīng)情況；制備抗 hMPV兔血清，用免疫印跡法檢測(cè)該血清與hMPV和RSV反應(yīng)性，進(jìn)一步排除RSV和hMPV之間存在交叉抗原的可能性。然后用hMPV感染的 Vero-E6 細(xì)胞裂解液為抗原，用ELISA法檢測(cè)325份0-6歲非呼吸道感染患兒和正常兒童的

3、血清標(biāo)本中hMPV IgG抗體。 結(jié)果：經(jīng) RSV 抗原吸附的血清與 RSV 抗原反應(yīng)性明顯降低，同一血清與 hMPV 的反應(yīng)性卻無明顯改變；免疫印跡法證實(shí)，用 hMPV抗原免疫家兔獲得的抗 hMPV 抗血清僅與 hMPV 抗原反應(yīng)，而不與RSV抗原反應(yīng)，提示RSV與hMPV間并無交叉抗原性。用ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)0-6歲兒童hMPV抗體平均陽性率為78.8％。而不同年齡組兒童血清中hMPV IgG抗體陽性率分別為：0-

4、5月組為74.5％，6-11月組為64％，12-23月、24-35月、3-6歲組分別為72.7％、90.3％、93.1％。在各年齡組中RSV與hMPV陽性率非常相近。 結(jié)論：hMPV 是重慶地區(qū)兒童常見的呼吸道病毒病原，既往感染率與RSV相似，至6歲時(shí)兒童幾乎均經(jīng)歷過hMPV感染。 PARTⅡ：重慶地區(qū)兒童血清人類偏肺病毒中和活性初步研究 目的：體液免疫中的重要組成部分中和抗體可以阻止病毒的吸附，在預(yù)防呼吸道疾病

5、的發(fā)生和疾病的恢復(fù)中起重要作用。hMPV 已被證實(shí)為我國兒童重要的呼吸道病毒病原之一，本研究擬初步分析重慶地區(qū)0-6歲兒童血清hMPV中和活性及與hMPV IgG抗體水平的關(guān)系，為進(jìn)一步大樣本的血清流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 方法：0-35月齡兒童血清來自因外科疾患住院的兒童，3-6歲兒童血清來自托幼兒童體檢血清，共50份血清標(biāo)本。采用微量中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述血清中hMPV中和活性，分析血清中和活性水平及其與hMPVIgG抗體水平的相關(guān)

6、性。 結(jié)果：在抽取的 50 份血清標(biāo)本中，此前通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)為陰性的8份標(biāo)本均未顯示中和活性，而42份hMPV IgG抗體陽性血清標(biāo)本中和活性均顯示陽性，平均中和滴度為1：129。其中0-5月組中和滴度均值為1：160，6-11月、12-23月、24-35月、3-6歲組中和滴度均值分別為1：58.9、1：114.9、1：172.8、1：160。血清中抗hMPV IgG抗體水平和中和活性具有顯著相關(guān)性，r=0.668

7、，但hMPVIgG水平與中和活性并不平行。 結(jié)論：0-6歲兒童血清中多具有hMPV中和活性，但其是否足以預(yù)防不同亞型hMPV感染尚待進(jìn)一步研究。 PARTⅢ：人類偏肺病毒融合蛋白基因的克隆和真核表達(dá) 目的：融合蛋白(fusion protein，F(xiàn))是病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白，其可以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，故在致病機(jī)制中扮演重要的角色。因此我們選擇構(gòu)建hMPV F基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過在昆蟲細(xì)胞 sf-9 中表達(dá)從而

8、獲得具有正確空間結(jié)構(gòu)及抗原性的重組 F 蛋白，為今后研發(fā)血清學(xué)診斷試劑、以及制備單克隆抗體與疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法：采用RT-PCR法擴(kuò)增人類偏肺病毒 A 亞型 F 基因的全長(zhǎng)序列，將序列片段插入供體質(zhì)粒pFastBacHT載體多克隆位點(diǎn)區(qū)，經(jīng)酶切鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac，供體質(zhì)粒與受體桿粒(Bacmid)發(fā)生位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座獲得重組的桿粒。采用脂質(zhì)體將重組桿粒轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲細(xì)胞sf-9，包裝獲得感染性桿狀病毒。用此病毒感染sf

9、-9細(xì)胞并表達(dá)蛋白，經(jīng)可結(jié)合6×His Tag的樹脂純化后用免疫印跡法驗(yàn)證表達(dá)蛋白。 結(jié)果：PCR 及序列分析證實(shí)所獲得的重組桿粒包含 hMPV 全長(zhǎng) F基因序列，被重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞 sf-9 顯示典型細(xì)胞病變效應(yīng)。采用抗 6×His 單克隆抗體為一抗，免疫印跡法檢測(cè)到分子量約70KDa的較單一的蛋白條帶，證實(shí)F蛋白表達(dá)成功。 結(jié)論：桿狀病毒是一高通量、目標(biāo)蛋白抗原性保存完好的表達(dá)系統(tǒng)。采用這一系統(tǒng)成功表達(dá)的h